Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

doi: 10.3791/3884 Published: June 8, 2012

Summary

Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.

Abstract

Nanopartikül sistemleri antijen sunan hücreler 1-5, verimli proteinler de dahil olmak üzere kargo, sağlama yeteneklerine aracılığıyla aşı teslim değerli araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Antijen sunan hücreler tarafından nanopartiküllerin içselleştirilmesi (NP) kapsüllü antijen için etkin bir bağışıklık yanıtı elde edilmesinde kritik bir adımdır. Nanoparçacık formülasyon etkisi işlevi nasıl değişiklikleri belirlemek için, biz içselleştirilmiş nanopartiküller yanı sıra bakteri tespit ile uyumlu olan bir yüksek verimlilik, nicel deneysel protokol geliştirmeye çalıştılar. Bugüne kadar, iki bağımsız teknikleri, mikroskobu ve akım sitometri, nanopartiküllerin fagositoz incelemek için kullanılan yöntemler olmuştur. Flow sitometri ile yüksek verimlilik doğa sağlam istatistiki veriler üretir. Ancak, düşük çözünürlük nedeniyle, doğru bir hücre bağlı nanopartiküller karşı içselleştirmiş ölçmek için başarısız olur. Mikroskopi yüksek uzaysal çözünürlüklü görüntü üretir; however, zaman alıcı ve küçük örneklem büyüklüğü 6-8 içerir. Çoklu-spektral görüntüleme akım sitometri (MIFC) laminar çekirdek ile eş zamanlı olarak çoklu renk spektral floresans ve parlak saha görüntüleme gerçekleştirir mikroskobu ve akım sitometri hem de yönlerini birleştiren yeni bir teknolojidir. Bu yetenek floresan sinyal yoğunluğu ve değişik yapıda ve yüksek hızda cep telefonu özellikleri arasındaki mekansal ilişkilerin doğru bir analizi sunar.

Bu yazıda, polianhidrid nanopartiküller veya Salmonella enterica serovar Typhimurium içselleştirmiş olmaları hücre popülasyonu karakterize etmek MIFC kullanan bir metodu tanımlar. Ayrıca nanoparçacık süspansiyonları, hücre etiketleme, bir ImageStream X sistemi üzerinde elde edilmesi ve IDEAS uygulamasını kullanarak veri analizi hazırlanmasını açıklar. Ayrıca interne p ayırt etmek için kullanılan bir tekniği uygulaması gösterilmektediraktin-aracılı fagositozunu bir inhibitörü olarak Sitokalazin-D kullanılarak nanopartiküller ve bakteriler için athways.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. RAW 264.7 Hücre Kültürü

  1. Kendilerinin bir hücre kazıyıcı ile onları hafifçe kazıyarak konfluense ulaşmak onların şişeleri ile Hasat RAW 264.7 hücreleri. % 10 ısı-inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 2 mM Glutamax; 5 x 10 5 hücrelik bir yoğunlukta / kuyu 0.5 mL komple Dulbecco Modified Eagle Medium (cDMEM içinde bir 24-kuyucuklu hücre kültürü çanağı içine sayısı ve plaka bunları ve 10 mM HEPES) ve% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.

2. Patojenik Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028 Dönüşüm ve Kültür

  1. S yeşil floresan protein (GFP) ifade rekombinant plazmid tanıtın. Elektroporasyon ile typhimurium. İlk olarak, LB broth Salmonella enterica serovar Typhimurium (ATCC 14028) kültür hazırlamak ve havalandırma ile 37 ° C'de bir gece inkübe edin.
  2. Ertesi gün, bir mikrosantrifüj maksimum hızda bakteri pelet 1 ml. Hücreler fo yıkayıpyavaşça her bir yıkama 9 arasında bir pipet ile pelet resuspending tarafından - soğuk MOPS / gliserol çözeltisi, 1 ml ((N-morfolino)% 20 gliserol içinde propan sülfonik asit (MOPS) tamponu 1 mM 3) ile ur kez. Nihai yıkamadan sonra, pAKgfp1 ya pAKgfplux1 plazmid DNA 0.5 ug Resimler ~ 10 eklenmiştir içine MOPS / 50 arasında gliserol içinde uL pelletini.
  3. Önceden soğutulmuş 1 mm boşluk elektroporasyon küvetine hücre süspansiyonu aktarın ve ayarları kullanarak electroporate: 1800 V, 200 W, 25 mF. Hemen darbe doğumdan sonra, LB suyu 1 mL eklemek ve yeni bir 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın. Hücreleri havalandırma ile 37 ° C'de kurtarmak için izin verin. Bir saat sonra, kalan süpernatan ~ 100 uL santrifujlemeden ve Pastör pipetiyle tarafından hücreleri konsantre.
  4. Son olarak, plaka 100 ug / ml ampisilin 37 ve bir gece boyunca inkübe içeren LB plakalar üzerine hücreleri ° C. Tek koloniler GFP i antibiyotik seçimi ve ifade ile restreaking saflaştınlırbir standart floresein izotiyosiyanat (FITC) filtre seti ile aydınlatma ile kesinleştirilir.
  5. Stabil ekspres GFP dönüştürülmüştür Salmonella loopful ile 25 mcg / ml ampisilin (veya uygun antibiyotik) içeren LB suyu 10 ml inoküle.
  6. 37 gece boyunca bakteri üremeye ° C
  7. 37 de 5 saat süre ile inkübe edilir ve ampisilin ile desteklenmiş 10 mL LB ° C. içeren taze kültür tüpü içine, Salmonella 01:10 ile seyreltilir
  8. 600 nm kültürünün absorbansı ölçülür ve önceden büyüme eğrisinin oluşturulması kullanarak mL başına Salmonella konsantrasyonu hesaplamak.
  9. RAW 264.7 hücre başına 100 arasında bir enfeksiyon çokluğu (MOI) elde etmek için cDMEM (0.5 mL / kuyu) içinde Salmonella seyreltilir.

3. Nanopartikül süspansiyonunun hazırlanması

  1. Daha önce açıklandığı gibi 11% 1 FITC yüklü nano parçacıklar imal. Kısaca, parçacıklar polianhidrid tarafından üretilmektedirPolimer metilen klorür içinde çözülmüş (4 ° C'de 25 mg / mL 'lik bir konsantrasyonda) ve pentan (: pentan bir oranı 1:200 metilen klorür az -30 ° C) içinde çökeltilmiştir edildiği anti-solvent nanoencapsulation,. Vakum filtrasyonu nanopartiküller kurtarın. Herhangi bir kalıntı çözücü buharlaştırma sonra, kurutulmuş polianhidrid steril kağıt ağırlığı kullanılarak nanoparçacıklar tartın.
  2. Soğuk fosfat 0.5 mL Nanopartiküllerin 5 mg ekleme tuzlu su, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde (PBS, kalsiyum ve magnezyum içermeyen, pH 7,4) ile tamponlanmış nanopartiküller RAW 264.7 hücrelere ilave edilir dek buz üzerinde tutmak.
  3. 4 ila 6 joule yaklaşık 25 s için mikrotip ile donatılmış bir ultrasonik sıvı işlemci kullanarak nanoparçacık süspansiyon (buz üzerinde tutarak) sonikasyon.

4. Fagositoz Assay

  1. Orta ve repl aspire önceden NP veya Salmonella tanıtımı için 5 mg / ml Sitokalazin-D 1 saat ile RAW 264.7 hücrelerin bir alt kümesini önceden işlemeinhibitörü ile desteklenmiş taze cDMEM ile acing. 37 ° C inkübatör için kültürler dönün.
  2. Inhibitörü ile 1 saatlik inkübasyondan sonra, kuluçka gelen plakaları kaldırmak vorteks nanoparçacık süspansiyon, ve uygun bir kuyucuklara 10 uL ekleyebilir.
  3. Vortex Salmonella ve uygun kuyulara bakteriler ekleyerek İçişleri Bakanlığı 100 ile RAW 264.7 hücreleri enfekte.
  4. 37 de karıştırılır ve inkübe için plaka birkaç kez dokunun ° C veya 45 dakika süreyle 4 ° C (kontrol).
  5. Inkübatör veya buz üzerinde buzdolabı ve yerden plakaları çıkarın. Buz gibi soğuk PBS ile iki kez hücre yıkayın (Ca 2 olmadan + ve Mg 2 +) ve Çekiş atarak ilişkisiz parçacıklar, Salmonella, ölü ya da müstakil RAW 264.7 hücreleri çıkarmak için eski orta tarafından.
  6. İkinci yıkamadan sonra RAW 264.7 hücreleri toplamak için, buz gibi soğuk PBS 250 uL ekleyip hafifçe kuyu kazımak.
  7. Net görüş ek kap içine mikro pipet hasat hücreleritüpler santrifüj ve buz üzerinde saklayın.
  8. 4 azından 10 dakika süreyle 250 x g'de 1 soğuk yıkama tamponu mL (% 2 ısıyla inaktive FBS, PBS içinde% 0.1 sodyum azit) ve santrifüj eklenerek ° C ile yıkanır hücreleri
  9. Süpernatant atın ve kağıt havlu üzerine ters mikrosantrifüj tüp dokunarak kalan tampon kaldırın. Hafifçe bir test tüpü rakı arasında mikrosantrifüj tüpü yan yatan tarafından hücre pelletini.
  10. PBS içinde% 4 paraformaldehit ile 100 uL (PFA) ekleyerek ve hücreler, oda sıcaklığında (RT) de 15 dakika boyunca bekletilmesi tarafından RAW 264.7 hücreleri sabitlemek.
  11. 4 azından 10 dakika süreyle 250 x g'de 1 Perm / Yıkama tamponu mL (BD Biosciences) ve santrifüj eklenerek ° C ile RAW 264.7 hücreleri yıkayıp
  12. Adım 4.9 tekrarlayın.
  13. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca; Alexa Fluor Phalloidin 660 (1:150 seyreltme AF 660) ihtiva Perm / Yıkama tamponu 100 ul ilave edilerek aktin RAW 264.7 hücreleri leke. Adımları 4.11 ve 4.12 tekrarlayın.
  14. 50 uL RAW 264.7 hücrelerinin yeniden süspanse edinPBS edinimi kadar% 1 PFA ve 4 karanlıkta saklayın ° C içeren.

İpuçları & notlar:

  • Tek renk floresan örnekleri ImageStream X aracı kurarken tazminat kontrol olarak kullanılmak üzere bu aşamada hazırlanmalıdır. ; RAW 264.7 hücreleri (aktin etiketli değil) Salmonella ile inkübe; aktin sadece etiketli RAW 264.7 hücreleri RAW 264.7 hücreleri (aktin etiketli değil) nano partiküller ile inkübe: telafisi vardı, bu deneye dahil kontrol eder.
  • Inhibitörü çalışmaları için, bu inhibitör, bir kontrol olarak çözünmüş edildiği aracın kontrolü de önemlidir. Bu deneyde, Sitokalazin-D% 100 DMSO içinde eritildi. Bu nedenle, cDMEM içeren DMSO içinde ve ardından inkübe edilen hücrelerde nanopartiküller ya Salmonella interne değerlendirilmiştir. Biz orta grup ve DMSO kontrolü (veriler gösterilmemiştir) arasında anlamlı bir farklılık tespit edilmedi.
  • SaAmnis web sitesi (mevcut mple hazırlama rehberi https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf ) ImageStream X florofor uyumluluğu kontrol etmek için iyi bir kaynaktır. Bu belgeye erişmek için, kullanıcılar ilk Amis ile (serbest-of-charge) kaydetmeniz gerekir.

5.. ImageStream X Numune Alma

  1. ImageStream X ve lansman kadar Güç INSPIRE.
  2. Fluidics başlatılamıyor. Bu komut SpeedBeads sonunda çalıştırıyor olmalıdır.
  3. Dosya menüsünde, Varsayılan Şablon Yükle'yi seçin.
  4. Resim Galerisi görünüm menüsünde TÜM seçin ve görüntüleme boncuklar başlatmak için Çalıştır Kurulum basın.
  5. Çekirdek yanal merkezi görüntüleri (gerekirse) İzleme ayarlayın.
  6. Aydınlık (BF) kanalı seçin ve Set Yoğunluk tıklayın.
  7. Akış Hız CV tutarlı le kadar bekleyin% 0,2 'den ss.
  8. Günlük Cihazın kalibrasyonu. ASSIST sekmesini tıklatın kalibrasyon ve testleri çalıştırmak için tüm Başlat ve tüm geçti doğrulayın.
  9. Ilk örnek yüklemek için Flush Kilit ve Yük (FLL) basın. Her florokrom ile fluoresces kullanılan deney en parlak örneği yükleyin. Bu, tüm deney için onları değiştirmek ETMEYİN sonra cihaz ayarlarını yapmak için ilk önce bu örneği çalıştırmak ve bu çok önemlidir.
  10. Deneyde kullanılan her laser açın ve her florokrom maksimum piksel değerleri olarak saçılım ölçülen 100 ila 4000 sayıları vardır bu nedenle Lazer Güç ayarlayın.
  11. Istenmeyen nesnelerin toplanması ortadan kaldırmak için, Hücre Sınıflandırma kriterleri ayarlayın. Sadece hücre veri toplamak için, 50 um için BF kanalda Alanı Alt Sınırı seçeneğini seçin. 50 um'den az alana sahip nesneler kalıntı olarak kabul edilir ve elde edilen edilmeyecektir. Tahsil edilecek kanalları seçin.
  12. Dosya Adı, Hedef Klasör, set Sıra girin# 1 ve kazanmak Olayların sayısı.
  13. İlk deneme veri dosyası toplamak ve kaydetmek için Acquire Çalıştır'ı tıklatın.
  14. FLL tıklayın ve bir sonraki deneysel örnek çalıştırın. Tüm deney örnekleri toplanmıştır kadar tekrarlayın.
  15. Zorunlu Ayarlar (aydınlık ve scatter lazer kapanır ve tüm kanallar toplama sağlar) tıklayın ve bir tazminat matris geliştirmek için deneyde fluorofor için tek tek her lekeli numuneden 500 pozitif hücre toplamak.

Özetlemek gerekirse, örnekler aşağıdaki sırayla çalıştırılabilir:

  • İlk parlak örnek.
  • Kalan test örnekleri.
  • Tazminat tek renk floresans içeren denetler.

İpuçları & notlar:

  • Bir INSPIRE şablon kaydedilir ve cihaz ayarlarını ayarlamak için tekrar edilebilir. Bir kez şablonları kaydedilir, otosampler'li bir şablon ve işbirliği ile deney numunelerinin çalışılabilmesi için katılımsız operasyon için kullanılabilirmpensation her bir renk kontrolü için bir şablon ile kontrol eder.
  • Bu deneyler için ImageStream X yapılandırma: 488 ve 658 nm eksitasyon lazerleri 785 nm lazer dağılım; 40X (0.75 NA) nesnel, standart bir ISX filtre yığını ile 6 kanal sistemi. Otomatik örnekleyici seçenek örnekleri istem kazanım izin vermek için kullanılmıştır.
  • Aşağıdaki ayarlar deney için kullanılmıştır. Nanopartiküller 10mW ayarlanmış 488 nm lazer ile görüntülendi, 658 nm lazer 50 mW ayarlanmış, 785 nm lazer kanal 1 2 mW ve BF ayarlanır. Salmonella enfekte olmuş hücrelerde, 20 mW olarak ayarlanmış 488 nm lazer ile görüntülendi 658 nm lazer 50 mW ayarlanmış, 785 nm lazer kanal 1 2 mW, ve BF ayarlanır. Compensation kontrol BF ve 785 yokluğunda toplandı. En az 5000 etkinlik (yani, hücreleri) de test örneklerinin her biri için görüntülendi.

6. Image Analysis

  1. FİKİRLER başlatın ve üzerinde İçselleştirme sihirbazı ve yük üzerine çift tıklayıntest örneği e. rif dosyaları.
  2. 2. adımda 'Yeni Matrix "tıklayarak bir tazminat matris oluşturun. Tazminat sihirbazı başlatılır. Deneyde tek renk kontrolleri için dosyaları ekleyin. Tazminat matris dosyası kaydedilir ve içselleştirilmesi sihirbazın 2. adımında kutuya yüklenene kadar yönergeleri izleyerek sihirbazı sonraki tıklayın.
  3. İleri'yi tıklatın ve bir. Daf dosya oluşturulana kadar yönergeleri izleyin.
  4. Edinimi sırasında kullanılan görüntü kanalları seçerek görüntü görüntü özelliklerini ayarlayın. Ch 2 (FITC) ve Ch 5 (AF 660) tıklayın. (BF ve SSC seçilen öntanımlı) vardır.
  5. Hücre sınırlarının (CH01) ve nanopartiküller veya bakteriler toplanmıştır hangi kanalda (CH02) hazırlamak için görüntü kanal seçilir.
  6. Hücrelerinin tüm aydınlık Oranı karşılık aydınlık Alanı bir dağılım çizim oluşturulur. Mayoları etrafında bireysel noktalar ve yolluk tıklayarak tek hücre nüfus tanımlayın. Tek hücreler bir boy oranıturu 1 ve 0.5 (Şekil 1A) çevresinde çiftler.
  7. Aydınlık Gradient Kök histogram aydınlık görüntü Meydanı (RMS) oluşturulur ve resim galerisi nüfusun görünümü seçili bin (Şekil 1B) olarak ayarlanır ortalama. En iyi odak hücreleri başlar ve kapı odaklı hücrelere bir çizgi çizmek bölge belirlemek için kutuları tıklayın. Yüksek Gradient RMS, odaklanmış daha iyi. Size kapısı istediğiniz diğer lekeleri olmadığı sürece bir sonraki adımı atlayın.
  8. Y ekseni üzerindeki Ch2 x-eksenine karşı Max Piksel tarihinde Kanal 2 Şiddeti yeni bir scatter plot (Şekil 1C) oluşturulur. Noktalar üzerine tıklayın ve nanopartiküller ya da bakteri için pozitif hücrelerin etrafındaki bölgeye çekmek için görüntüleri.
  9. İçselleştirme özelliğin bir histogram görüntüler (Şekil 1D) gözlemleyerek ayarlanmalıdır 0 başlar bir bölge oluşturulur. İçselleştirme özelliği lik bir oran olduğutam hücre yoğunluğuna hücre içinde yoğunluğu. Bu yoğunluğu yaklaşık yarısı 0 arasında bir değerde içinde olduğu gibi ölçeklendirilir. Sihirbaz hücre yüzeyine bulmak için adım 5 hücre görüntü giriş kullanılan ve 4 piksel bu aşındırdı bir maske yaparak içinde belirlemek için bir bölge yaratmıştır. Bu maskenin elle farklı hücre tipleri gerektiğinde için ayarlanabilir unutmayın. Bu deneyde, elle ilk aydınlık görüntü üzerinde bir nesne maske oluşturarak özelliği ayarlanır ve 4 piksel bu aşınmış. İçselleştirme özelliği daha sonra bu 4 piksel aşınmış Nesne maskesi göre hesaplandı. Bu özellik bize maskesi sınır (Şekil 2) dışında kendi floresans sinyalinin çoğunluğuna sahip yüzeye bağlı partikül ve bakterilerden maskesi sınırları içinde floresans sinyalinin çoğunluğuna sahip içselleştirilmiş parçacıklar ve bakteriler,,, ayırmasına olanak sağlar.
  10. FEA yeni İçselleştirme olan yeni bir histogram oluşturmaaşınmış Nesne maskesi dayalı olarak te. Seçilen bin modunda görüntüleri inceleyen tarafından içselleştirilmiş hücreleri üzerine kapısına bir bölge çizin. Deneylerde, biz 0.3 bu kapıdan ayarlayın. 0.3 puanının düşük olan hücreler yüzeye bağlı parçacık pozitif hücreler olarak kabul edildi.
  11. Son olarak, arka etiketleme hücreleri ortadan kaldırmak ve spesifik içselleştirilmiş nanopartiküller veya bakteri belirlemek için, IDEAS Nokta Sayım özelliği kullanılmıştır. Nokta sayımı bağlı parçalar veya görüntünün küçük maskeleri sayar bir özelliktir. Maske fonksiyonları, Spot, Peak ve Yoğunluk noktaları tanımlamak için kullanılmıştır. Nokta maskesi kullanıcının belirtilen yarıçapı ve yerel plan üzerinde eşik var, bir görüntüdeki parlak detaylar bulur, maske 200 sayımları yoğunluk yukarıda Tepe fonksiyonu ve daha sonra lekeler kullanarak tek tek nokta halinde yüksek yoğunluklarda parçalanması suretiyle rafine edilir alındı . Ayrıntılı bilgi (Şekil 1E) için Amnis nokta maskeleme kılavuzuna bakın. A istatistikleri yeniden port şablonu Raporlar menüsünde çeşitli özellikler de dahil olmak ile oluşturulmuştur.
  12. Şablon dosyası tüm deneysel dosyaların toplu analiz için kullanılmak üzere bu dosya kurtarıldı.
  13. FİKİRLER yazılımında, Araçlar → Toplu Veri Dosyaları ve giriş tüm. Rif dosyaları tıklatın. Tazminat matris dosyası (. CTM) ve ilgili bölümlerde şablon dosyası (. Ast) ekleyin. Işlenmesi için kesikli konumundadır. Işlem adım tamamlandıktan sonra, bütün. Rif dosyaları ve analiz edilmiştir. Daf dosyaları tek tek ham dosyaların her biri için oluşturulur. Son bir rapor dosyası, tüm örnekler için istatistikleri ile oluşturulur.

İpuçları & notlar:

  • Görüntü analizi FİKİRLER yazılım sürümü 4.0 ve bazı değişikliklerle birlikte İçselleştirme sihirbazı kullanılarak gerçekleştirildi. Sihirbaz kendini öğreticidir ve ouptput. Daf dosyası sihirbazın yönergeleri izleyerek oluşturulabilir.

7. Temsilcisi Sonuçlar

"> Şekil 2'de temsili görüntüler olduğunu MIFC başarıyla içselleştirilmiş (sol panel) ayırt etmek için kullanılabileceğini göstermektedir karşı yüzey sınır (sağ panel) NP (Şekil 2A) veya Salmonella (Şekil 2B). NP ve Salmonella içselleştirilmesi azalmıştır inhibe aktin ve 4 ° C (Şekil 3A) sıcaklığı düşürücü hem. bağlı yüzey için pozitif hücrelerin yüzdesi NP (ya Sitokalazin-D ya da 4 ° C tedavisinden sonra daha fazla% 35 ila 37 ° C sıcaklıkta yaklaşık 8 'den% Şekil 3B). Bunun aksine, yüzeye bağlı Salmonella sahip hücrelerin yüzdesi Sitokalazin-D tedaviyi takiben% 35 ila% 15 oranında düşürülmüştür. 4 azından Salmonella RAW 264.7 hücrelerinin Kuluçka ° C miktarında belirgin bir artış olmadan interne azalma 37 ° C kontrole göre yüzey bakteri bağlı. birlikte, bu veriler göstermektedir <em> Salmonella ve NP aktin gerektirir ve sıcaklığa bağlıdır benzer hücresel süreci tarafından içselleştiriliyor. Dahası, veriler için makrofajlar, Salmonella bu sürekli bağlanma aktin polimerizasyon gerektirir göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1.. Yüzeye bağlı nanopartiküller ve Salmonella karşılık içselleştirmiş belirlemek için kullanılmıştır perdeleme stratejisinin şematik. (A), tek hücrelerin analizi sınırlamak için, bu döküntüleri ve çok-hücresel olayları ortadan kaldırmak için önemlidir. Tek hücre ve çiftler FİKİRLER özellikleri alanı ve aydınlık görüntü (M01) görünüş oranını kullanarak çok hücreli agrega ayrıldı. Çiftler genellikle Aspe var; Alan kare mikron ve boy oranı görüntünün boyutu ana ekseni ve bu nedenle dairesellik bir ölçü (mükemmel bir daire 1 boy oranı olacak bölünmüş küçük eksenict yaklaşık 0.5 oranları ve çokhücreli agregalar) tipik olarak 0.5 'den az bulunmaktadır. Bir bölgede tek bir hücre olayları (Adım 6.6) üzerine kapısı çizilmiş oldu. (B)-odak hücreleri üzerinde kapısı için, FİKİRLER aydınlık görüntü Gradient RMS bir histogram çizilir bulunuyor. Gradient RMS özelliği görüntüdeki piksel değerleri değişiklikleri tespit ederek bir görüntünün netliğini kalitesini ölçer. Daha yüksek Gradient RMS değeri daha odaklı bir görüntü (Adım 6.7) gösterir. (C) Yeşil floresan pozitif hücreler yüksek Max Piksel değerleri ve yeşil floresan kanal (Adım 6.8) Yoğunluk ile hücreleri üzerinde yolluk tarafından seçildi. (D) içselleştirilmiş NP veya Salmonella ile hücreler eşit veya 0.3 den büyük bir içselleştirme skoru hücre popülasyonunu seçerek seçildi. Bir puan az 0,3 alan hücreler yüzeye (Adım 6.9) bağlı olarak kabul edildi. (E) "içselleştirilmiş" kapı hücreler daha noktaların sayısı (NP ve STM) nedeniyle termal dayalı karakterize edildie içselleştirilmiş sayıldı arka plan boyama ile bazı hücreler vardı ama sıfır (Adım 6.11) bir spot vardı. Temsilcisi görüntüleri her kapı için sunulmuştur. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2
Şekil 2. Içselleştirilmiş ve yüzey sınır nanopartiküller (NP) veya Salmonella Hücre görüntüler. (A) içselleştirilmiş NP (sol panel) ve hücreler NP, yüzey bağlı değil (sağ panel) içselleştirilmiş değildi o RAW 264.7 hücrelerinin Temsilcisi görüntüler. (B) içselleştirilmiş Salmonella (sol panel) ve hücreler Salmonella, yüzey bağlı değil (sağ panel) içselleştirilmiş değildi o RAW 264.7 hücrelerinin Temsilcisi görüntüler.

Şekil 3
Şekil 3. Cytochalahücre günah-D tedavi NP ve Salmonella içselleştirilmesi inhibe. Sitokalazin-D ile RAW 264.7 hücrelerin (A) Ön hazırlık ortamında 37 ° C'de inkübe RAW 264.7 hücrelerine kıyasla ya da 4 ° C de inkübe NP veya Salmonella interne etme oranı azaltılmış. DMSO (yani araç kontrolü) içeren ortamda inkübe RAW 264.7 hücreleri tek başına orta (veriler gösterilmemiştir) göre NP ve Salmonella için benzer içselleştirilmesi seviyeleri gösterdi. (B) Sitokalazin-D ile RAW 264.7 hücrelerin ön yüzeyine bağlanmış Salmonella hücrelerin yüzdesi düşürürken yüzeyine bağlanmış olan NP hücrelerinin oranında artmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Çalışmalar poli (laktik-co-glikolik asit (PLGA) veya polyanhydrides dayalı biyolojik olarak parçalanabilir nanopartiküller Hedef hücrelere kapsüllenmiş antijenler ya da ilaçlar sağlamak için de kullanılabilir olduğunu göstermiştir. Fagositik hücreleri tarafından bu Nanopartiküllerin Uptake böylece niceliksel verme, etkinliğinin için önemlidir . roman nanoparçacık dağıtım sistemlerinin tasarımında kritik içselleştirme analizi bu yöntemi kullanarak, çeşitli hücre tipleri tarafından nanopartiküllerin diferansiyel alımı kolaylığı ile analiz edilebilir, geleneksel mikroskobu ve akım sitometri Bugüne kadar parçacık alımı hesaplamak için kullanılmıştır;. Ancak, kendi yüksek verimlilik ve içselleştirilmesi çalışmak için alternatif yaklaşımlar için çözünürlük çağrısı ile sınırlamalar. Bu yazıda, karakterize ve fagositoz biyolojik süreci hedefleri-bakteriyel bir patojen ve sentetik nanopartiküllerin iki tür arasında nasıl farklı karşılaştırmak MIFC analiz.

MIFC phagocytosassay nanopartiküller ile karşılaştırıldığında, Salmonella uptake yatan mekanizması farklılıklar tanımlamak için kullanılan edilir. Bu inhibitörleri, inkübasyon süresi ve konsantrasyona bağlı olarak sitotoksik olabileceği unutulmamalıdır; dolayısıyla bir önceki sitotoksisite profil (yani, maruz kalma süresi ve konsantrasyon) kullanımları 13,14 önce gerekli olan. Kimyasal formül bağlı olarak, nanopartiküller bir cam geçiş sıcaklığı (Tg = 13 ° C) RT aşağıda sahip olabilir, dolayısıyla, RT 15 az agregatlar oluştururlar. Agregasyon üstesinden gelmek için, bu parçacıkların sonike ve hücre kültürlerinin ilave edilmeden önce buz üzerinde tutulur bunların. Nanoparçacık alımını Kinetik çalışmalar antijen sunan hücrelere kapsüllü yükü teslim etmek için bu parçacıkların verimliliği hakkında önemli bilgiler sağlar. Care fazla hücresel süreçler inhibe etmek için, belirli bir zaman noktasında sonunda hücreler buz üzerinde tutmak için özen gösterilmelidir. Bu amaçla, cellula değişkenlik belirttiğimizhücreler buz üzerine yerleştirilir değildi r alımı. Yukarıda tarif edilen yöntemin bir sınırlandırma deneyi fagositik hücreler hasat etmek için teknikler kazıma gerektiren yapışık hücreleri üzerinde gerçekleştirilen olmasıdır. Bu prosedür, böylece veri analizinde bazı hata tanıtan, hücre ölümüne neden olabilir. Biz burada tarif prosedür de süspansiyon büyümeye hücreleri kullanılarak yapılabilir.

Reaktif boyalar veya immün reaktifleri ile makrofajların kuluçka kalan tampon mevcut aşağıdaki fiksasyon miktarını azaltarak optimize edilmiştir. Kalıntı tampon mevcudiyetinde ve böylece ortalama tutarsız floresans yoğunluğunu değerleri ile sonuçlanan bir seyreltme etkisi yaratır ve birden fazla örnekleri arasında Örnek varyasyona Örnek üretebilir. Örnek konsantrasyonu (yani, hücre / ml), aynı zamanda uzun vadede zamanlarda numuneler sonucunda, satın alma aşamasında dikkate almak önemli bir faktördür. Farklı arasında bir çok-parametrik karşılaştırma içinDeneysel örnekler, bu lazer yoğunluğu sabit tutmak için önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Sherree L. Arkadaş ImageStream X sistem üretmektedir Amnis Corporation tarafından istihdam edilmektedir.

Acknowledgments

Yazarlar için mali ONR-MURI Ödülü (NN00014-06-1-1176) ve ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (Grant Numaraları W81XWH-09-1-0386 ve W81XWH-10-1-0806) teşekkür etmek istiyorum destekliyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RAW 264.7 cell line American Type Culture Collection (ATCC) TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cellgro 10-013-CV
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S 11150 Premium Grade
Glutamax GIBCO, by Life Technologies 35050-061
HEPES GIBCO, by Life Technologies 15630-080
24-well plate Techno Plastic Products 92024
Cell culture Flasks Techno Plastic Products 90151
Cell scraper Techno Plastic Products 99002 24 cm
Salmonella entericaserovar Typhimurium ATCC 14028
BTX ECM630 Electro Cell Manipulator BTX Technologies
MOPS Fisher Scientific BP308
Phosphate buffered saline (PBS) Cellgro 21-040-CV
Ultrasonic liquid processor Misonix S-4000
Cytochalasin-D Sigma-Aldrich, C8273
Formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Wash buffer 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS.
Perm/wash buffer BD Biosciences 554714
Clear-view snap cap microtubes Sigma-Aldrich T4816
Alexa Fluor phalloidin 660 Invitrogen A22285
ImageStreamX Amnis Corporation 100200 Options: 658nm laser, autosampler
Sodium azide Fisher Scientific S 227I-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
  2. Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
  3. Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
  4. Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
  5. Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
  6. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
  7. Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
  8. Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
  9. Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
  10. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
  11. Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
  12. Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
  13. Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
  14. Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
  15. Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., Phillips, G. J., Narasimhan, B., Wannemuehler, M. J., Bellaire, B. H. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884, doi:10.3791/3884 (2012).More

Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., Phillips, G. J., Narasimhan, B., Wannemuehler, M. J., Bellaire, B. H. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884, doi:10.3791/3884 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter