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Bioengineering

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

doi: 10.3791/3884 Published: June 8, 2012

Summary

In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung von Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie, um die Internalisierung von Polyanhydrid Nanopartikel oder Bakterien durch RAW 264.7-Zellen zu quantifizieren.

Abstract

Nanopartikel-Systemen haben als wertvolle Hilfsmittel zur Verabreichung von Impfstoffen durch ihre Fähigkeit, effizient zu liefern Fracht, einschließlich Proteine ​​entstanden, auf Antigen-präsentierenden Zellen 1-5. Internalisierung von Nanopartikeln (NP) von Antigen-präsentierenden Zellen ist ein kritischer Schritt bei der Erzeugung einer Immunantwort gegen das verkapselte Antigen. Um, wie sich Änderungen in Nanopartikel-Formulierung auswirken Funktion zu bestimmen, haben wir versucht, einen hohen Durchsatz, quantitative experimentelle Protokoll, das kompatibel mit Erkennung internalisierte Nanopartikel sowie Bakterien war zu entwickeln. Bis heute wurden zwei unabhängige Techniken, Mikroskopie und Durchflusszytometrie, waren die Methoden benutzt, um die Phagozytose von Nanopartikeln zu untersuchen. Der hohe Durchsatz Natur der Durchflusszytometrie erzeugt robuste statistische Daten. Jedoch aufgrund der niedrigen Auflösung, schlägt es genau zu quantifizieren verinnerlicht gegenüber Zelle gebundenen Nanopartikeln. Mikroskopie erzeugt Bilder mit hoher räumlicher Auflösung; however, es ist zeitaufwendig und birgt kleinen Stichproben 6-8. Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie (MIFC) ist eine neue Technologie, die sowohl Aspekte der Mikroskopie und Durchflusszytometrie, die Multi-Color-spektralen Fluoreszenz-und Hellfeld-Bildgebung führt gleichzeitig durch eine Laminar-Kern enthält. Dadurch ist eine genaue Analyse des Fluoreszenzsignals Intensitäten und räumlichen Beziehungen zwischen unterschiedlichen Strukturen und zellulären Eigenschaften bei hoher Geschwindigkeit.

Hier beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung MIFC um die Zellpopulationen, die Polyanhydrid Nanopartikel oder Salmonella enterica Serovar Typhimurium verinnerlicht haben zu charakterisieren. Wir beschreiben die Herstellung von Nanopartikel-Suspensionen, Zellmarkierung, Erwerb auf einem ImageStream X-System und die Analyse der Daten mit Hilfe des IDEAS-Anwendung. Darüber hinaus zeigt die Anwendung einer Technik, die verwendet werden, um die Internalisierung p unterschieden werden könnenathways für Nanopartikel und Bakterien mit Cytochalasin-D als ein Inhibitor der Aktin-vermittelte Phagozytose.

Protocol

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1. RAW 264.7 Cell Culture

  1. Ernte RAW 264.7-Zellen aus ihren Flaschen, wenn sie Konfluenz durch Abkratzen sie leicht mit einem Zellschaber erreichen. Anzahl und der Platte diese in eine 24-Loch-Mikrotiterplatte mit einer Dichte von 5 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 0,5 ml komplettem Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (cDMEM, 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamax, und 10 mM HEPES) und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einer 5% CO 2 inkubiert.

2. Pathogene Salmonella enterica Serovar Typhimurium 14028 Transformation und Kultur

  1. Einführung rekombinanter Plasmide, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) bis S. Typhimurium durch Elektroporation. Zuerst bereiten Kultur von Salmonella enterica Serovar Typhimurium (ATCC 14028) in LB-Brühe und über Nacht bei 37 ° C mit Belüftung.
  2. Am nächsten Tag, Pellet 1 ml Bakterien bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge. Waschen Sie die Zellen four mal mit 1 ml kaltem MOPS / Glycerin-Lösung (1 mM 3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure (MOPS)-Puffer in 20% Glycerol) durch vorsichtiges Resuspendieren des Pellets mit einer Pipette zwischen jedem Waschschritt 9. Nach dem letzten Waschen, das Pellet in 50 ul MOPS / Glycerin, in die 0,5 ug pAKgfp1 pAKgfplux1 oder Plasmid-DNA wurde ~~~V 10 aufgenommen.
  3. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine vorgekühlte Abstand von 1 mm Elektroporationsküvette und elektroporieren mit den Einstellungen: 1800 V, 200 W, 25 mF. Unmittelbar nach Impulsabgabe, 1 ml LB-Nährlösung und übertragen die Zellsuspension auf eine neue 15-ml-Röhrchen. Lassen Sie die Zellen bei 37 ° C mit Belüftung zu erholen. Nach einer Stunde, konzentrieren die Zellen durch Zentrifugation und Resuspension in ~ 100 L verbleibende Überstand.
  4. Schließlich Platte die Zellen auf LB-Platten mit 100 ug / ml Ampicillin und über Nacht bei 37 ° C Einzelne Kolonien werden durch restreaking mit Antibiotika-Selektion und Expression von GFP i gereinigts bestätigt durch Beleuchten mit einem Standard-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Filtersatz.
  5. Animpfen von 10 ml LB-Bouillon mit 25 ug / ml Ampicillin (oder einer geeigneten Antibiotika) mit einer Öse Salmonellen, die stabil exprimieren GFP transformiert wurde.
  6. Wachsen die Bakterien über Nacht bei 37 ° C.
  7. Verdünnen Sie Salmonella 1.10 in eine frische Kultur Röhrchen mit 10 ml LB mit Ampicillin und Inkubation für 5 h bei 37 ° C ergänzt
  8. Die Absorption der Kultur bei 600 nm und die Konzentration der Salmonellen-pro ml unter Verwendung eines zuvor herzustellen Wachstumskurve.
  9. Verdünnen der Salmonellen in cDMEM (0,5 ml / Vertiefung), um eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 100 pro RAW 264.7-Zelle zu erhalten.

3. Vorbereitung der Nanopartikel-Suspension

  1. Fabrizieren 1% FITC-beladenen Nanopartikel wie zuvor beschrieben 11. Kurz gesagt, werden Teilchen, die durch Polyanhydrid hergestelltAntilösungsmittel Nanoverkapselung, in dem das Polymer in Methylenchlorid gelöst (4 ° C bei einer Konzentration von 25 mg / ml) extrahiert und in Pentan (-30 ° C bei einem Verhältnis von 1:200 Methylenchlorid: Pentan). Recover Nanopartikel durch Vakuumfiltration. Nach dem Eindampfen das restliche Lösungsmittel, wiegen die getrockneten Polyanhydrid Nanopartikel unter Verwendung sterilisiert wiegen Papier.
  2. In 5 mg von Nanopartikeln zu 0,5 ml kalter Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, Calcium und Magnesium, pH 7,4) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und hält sie auf Eis, bis die Nanopartikel an die RAW 264.7-Zellen zugegeben.
  3. Beschallen des Nanopartikel-Suspension (während auf Eis) mit einem Ultraschall-Flüssigkeit-Prozessor mit einer Mikrospitze für ca. 25 s bei 4 bis 6 Joule ausgestattet.

4. Phagozytose Assay

  1. Vorbehandelt eine Teilmenge der RAW 264.7-Zellen mit 5 pg / ml Cytochalasin D-1 Stunde vor der Einführung der NP oder Salmonella durch Absaugen Medium und replacing mit frischen cDMEM mit dem Inhibitor ergänzt. Senden Sie die Kulturen auf 37 ° C Inkubator.
  2. Nach 1 h Inkubation mit dem Inhibitor, entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator, Wirbel der Nanopartikel-Suspension, und fügen Sie 10 ul in die entsprechenden Vertiefungen.
  3. Vortex die Salmonellen infizieren und die RAW 264.7-Zellen mit einer MOI von 100, indem die Bakterien in die entsprechenden Vertiefungen.
  4. Tippen die Platte einige Male zu mischen und bei 37 ° C oder 4 ° C (Kontrolle) für 45 min.
  5. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator oder Kühlschrank und auf Eis stellen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +) durch Absaugen und Verwerfen des alten Mediums, um ungebundene Partikel, Salmonellen, und tot oder freistehende RAW 264.7-Zellen zu entfernen.
  6. Um die RAW 264.7-Zellen nach dem zweiten Waschen ernten, fügen Sie 250 ul eiskaltem PBS und sanft kratzen die Brunnen.
  7. Pipettieren Sie die geernteten Zellen in Klarsicht-Schnappdeckel MikroZentrifugenröhrchen und bewahren Sie sie auf Eis.
  8. Die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml kaltem Waschpuffer (2% hitzeinaktiviertem FBS, 0,1% Natriumazid in PBS) und Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 4 ° C
  9. Überstand verwerfen und Reste von Waschpuffer durch Antippen des invertierten Mikrozentrifugenröhrchen auf ein Papiertuch. Das Zellpellet durch leichtes harken die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Reagenzglas Rack.
  10. Befestigen der RAW 264.7-Zellen durch Zugabe von 100 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS und die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur (RT) stehen.
  11. Waschen Sie die RAW 264.7-Zellen durch Zugabe von 1 ml Perm / Wash-Puffer (BD Biosciences) und Zentrifuge bei 250 x g für 10 min bei 4 ° C
  12. Wiederholen Sie den Schritt 4.9.
  13. Flecken auf den RAW 264.7-Zellen für Aktin durch Zugabe von 100 ul Perm / Wash-Puffer mit Alexa Fluor 660 Phalloidin (AF 660; 1:150 Verdünnung) für 15 min bei RT. Wiederholen Sie die Schritte 4.11 und 4.12.
  14. Resuspendieren RAW 264.7-Zellen in 50 ulPBS mit 1% PFA und speichern sie im Dunkeln bei 4 ° C bis Akquisition.

Tipps & Hinweise:

  • Einzel-Farben-Fluoreszenz der Proben bei diesem Schritt bereit sein, als Entschädigung Kontrollen verwendet werden, während der Einrichtung des X ImageStream Instrument. Die Entschädigung regelt enthalten in diesem Experiment waren: RAW 264.7-Zellen (nicht für Aktin markiert) mit Nanopartikeln inkubiert; RAW 264.7-Zellen (nicht für Aktin markiert) mit Salmonella inkubiert; Aktin nur beschriftet RAW 264.7-Zellen.
  • Für die Studien-Inhibitor, ist es wichtig, das Fahrzeug Steuerung, bei der der Inhibitor als Kontrolle gelöst sind. In diesem Experiment wurde Cytochalasin D-in 100% DMSO gelöst. Wir haben deshalb inkubierten Zellen in cDMEM haltigen DMSO und dann die Internalisierung von Nanopartikeln oder Salmonellen untersucht. Wir zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen der mittleren Gruppe und DMSO-Kontrolle (Daten nicht gezeigt).
  • Die SAmple Vorbereitung Guide auf der Website Amnis ( https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf ) ist eine gute Ressource für die Überprüfung der Vereinbarkeit mit der Fluorophore ImageStream X. Um dieses Dokument zu gelangen, müssen Anwender sich zunächst registrieren (kostenlos-of-charge) mit Amis.

5. Probennahme auf der ImageStream X

  1. Power up ImageStream X und Markteinführung von INSPIRE.
  2. Initialisieren Fluidics. Am Ende dieses Skripts SpeedBeads sollte ausgeführt werden.
  3. Im Menü Datei wählen Sie Load Default Template.
  4. In der Bildergalerie Menü View die Option ALLE und drücken Setup ausführen, um die Perlen zu starten Bildgebung.
  5. Passen Core-Tracking-Center, um Bilder seitlich (falls erforderlich).
  6. Wählen Sie das Hellfeld (BF) und klicken Sie auf Kanal eingestellte Intensität.
  7. Warten Sie, bis die Strömungsgeschwindigkeit Lebenslauf ist konsequent less als 0,2%.
  8. Kalibrieren Sie das Gerät täglich. In der ASSIST Registerkarte klicken Sie auf Start, um alle Kalibrierungen und Tests ausführen und überprüfen, dass alle bestanden haben.
  9. Drücken Sie Flush Lock and Load (FLL), die erste Probe zu laden. Laden der hellsten Probe des Experiments, dass fluoresziert mit jedem Fluorochrom verwendet. Es ist wichtig, dass Sie dieses Beispiel zum ersten Mal ausgeführt, um die Geräteeinstellungen zu etablieren und dann Ändern Sie sie nicht für das gesamte Experiment.
  10. Schalten Sie jeden Laser im Experiment verwendet und stellen Sie die Leistung des Lasers, so dass jedes Fluorochrom hat max Pixel-Werte zwischen 100 und 4000 Zähler, wie in den Streudiagramme gemessen.
  11. Stellen Sie Zellklassifizierung Kriterien, auf die Sammlung von unerwünschten Objekten zu beseitigen. Für die Erhebung von Daten nur aus den Zellen, wählen Sie den Bereich untere Grenze in BF-Kanal bis 50 um. Objekte mit einer Fläche kleiner als 50 um werden als Schutt und werden nicht erworben werden. Wählen Sie Kanäle gesammelt werden.
  12. Geben Sie den Dateinamen, Zielordner, stellen Sequence# 1 und die Zahl der Veranstaltungen zu erwerben.
  13. Klicken Sie auf Ausführen Erwerben Sie zu sammeln und speichern Sie das erste Experiment Datendatei.
  14. Klicken Sie FLL und führen Sie das nächste experimentelle Probe. Wiederholen, bis alle experimentellen Daten erfasst wurden.
  15. Klicken Sie auf Comp-Einstellungen (schaltet Hellfeld-und Scatter-Laser und ermöglicht die Erfassung aller Kanäle) und sammeln Sie 500 positive Zellen, die aus jedem einzelnen gefärbten Probe für jedes Fluorophor im Experiment, um eine Entschädigung Matrix zu entwickeln.

Zusammenfassend lassen sich die Proben in der folgenden Reihenfolge ausgeführt werden:

  • Brightest ersten Probe.
  • Verbleibende Testproben.
  • Die Entschädigung regelt, die einzige Farbe Fluoreszenz.

Tipps & Hinweise:

  • Ein INSPIRE Vorlage können gespeichert und wieder geladen sein, die Geräteeinstellungen festlegen. Sobald Vorlagen gespeichert werden, kann der Autosampler für den unbeaufsichtigten Betrieb genutzt werden, um die experimentellen Proben mit einer Schablone und der Zusammenarbeit laufenmpensation steuert mit einer Vorlage für jede einzelne Farbe Kontrolle.
  • Die ImageStream X-Konfiguration für diese Experimente: 488 und 658 nm Anregungs-Laser; 785 nm Laser-Streuung; 40X (0,75 NA) objektiv, 6-Kanal-System mit einer Standard-ISX Filterstapel. Der Autosampler Option wurde benutzt, um unbeaufsichtigte Erwerb der Proben zu ermöglichen.
  • Die folgenden Einstellungen wurden für das Experiment verwendet. Nanopartikel mit der 488 nm-Laser 10 mW eingestellt wurden abgebildet, die 658 nm-Laser auf 50 mW eingestellt ist, stellen die 785 nm-Laser bis 2 mW und BF im Kanal 1. Salmonellen infizierten Zellen wurden mit der 488 nm-Laser auf 20 mW abgebildet wird, 658 nm-Laser auf 50 mW, 785 nm gesetzt die Laser bis 2 mW, und BF im Kanal 1. Kompensation Kontrollen wurden in Abwesenheit von BF und 785 gesammelt. Mindestens 5000-Ereignisse (zB Erythrozyten) wurden für jede der Proben abgebildet.

6. Bildanalyse

  1. Starten Sie Ideen und auf der Internalisierung Assistenten und Last auf doppelklicken Sie aufe der Probe. rif Dateien.
  2. Erstellen Sie eine Entschädigung Matrix, indem Sie auf "Neue Matrix" in Schritt 2. Die Entschädigung wird gestartet. Fügen Sie Dateien für die einzelnen Steuerelemente in der Farbe experimentieren. Klicken Sie neben dem Assistenten folgen Richtungen, bis der Ausgleich Matrix-Datei gespeichert und geladen in die Box in Schritt 2 des Assistenten Internalisierung.
  3. Klicken Sie auf Weiter und folgen Sie den Anweisungen, bis ein. DAF-Datei generiert wird.
  4. Stellen Sie Bildanzeige Eigenschaften durch die Auswahl der Bild-Kanäle während der Akquisition genutzt. Klicken Sie auf Kanal 2 (FITC) und Ch. 5 (AF 660). (BF und SSC sind standardmäßig aktiviert).
  5. Wählen Sie das Bild Kanal für die Herstellung der Zellgrenze (CH01) und dem Kanal, in denen Nanopartikel oder Bakterien wurden gesammelt (CH02).
  6. Ein Streudiagramm von Hellfeld Fläche im Vergleich Hellfeld Seitenverhältnis von allen Zellen erzeugt wird. Definieren Sie die einzelnen Zellpopulation, indem Sie auf einzelne Punkte und Gating um Singuletts. Einzelne Zellen ein Seitenverhältnis von aRunde 1 und Dubletten rund 0,5 (Abbildung 1A).
  7. Ein Histogramm der Hellfeld Gradient Root Mean Square (RMS) des Hellfeld-Bild erzeugt wird und die Bevölkerung Ansicht in der Bildergalerie wird an ausgewählte bin (Abbildung 1B) eingestellt. Klicken Sie auf den Behältern zu bestimmen, wo Zellen in besten Fokus zu beginnen und ziehen Sie eine Linie zum Tor Region konzentriert Zellen. Je höher der Gradient RMS, desto besser fokussiert. Den nächsten Schritt überspringen, es sei denn andere Flecken Sie sind auf Tor.
  8. Eine neue Streudiagramm der Intensität von Kanal 2 auf der x-Achse gegen Max Pixel von CH2 auf der y-Achse erzeugt wird (Abbildung 1C). Klicken Sie auf die Punkte und betrachten Sie die Bilder, um Ihnen zeichnen die Region rund um den Zellen, die positiv für Nanopartikel oder Bakterien sind.
  9. Ein Histogramm der Internalisierung Funktion mit einem Bereich, der bei 0 beginnt, die durch Beobachtung Bilder (1D) angepasst werden sollten erzeugt. Die Internalisierung Merkmal ist ein Verhältnis derIntensität innerhalb der Zelle zu der Intensität der gesamten Zelle. Es wird so skaliert, dass bei einem Wert von 0 etwa die Hälfte der Intensität im Inneren. Der Assistent hat eine Region, um das Innere, indem Sie eine Maske, die die Zelle der Eingänge verwendet, das von Schritt 5 an die Zelloberfläche zu finden und erodiert diese um 4 Pixel bezeichnen erstellt. Beachten Sie, dass diese Maske manuell für verschiedene Zelltypen bei Bedarf eingestellt werden. In diesem Experiment haben wir manuell die Eigenschaft, um ein Objekt Maske auf der Hellfeldbild zuerst eingestellt und erodiert diesen um 4 Pixel. Die Internalisierung Feature wurde dann auf der Grundlage dieses 4-Pixel-Maske erodierten Objekt berechnet. Dieses Feature ermöglicht es uns, verinnerlichten Partikeln und Bakterien, die den Großteil ihrer Fluoreszenz-Signal innerhalb der Maske Grenze haben, von der Oberfläche gebundenen Partikel und Bakterien, die den Großteil ihres Fluoreszenzsignals außerhalb der Maske Grenze (Abbildung 2) zu unterscheiden.
  10. Erstellen Sie eine neue Histogramm mit der neuen Internalisierung FEAtur basierend auf dem erodierten Objekt Maske. Zeichnen Sie eine Region, um Tor auf verinnerlichte Zellen, indem Sie die Bilder in ausgewählten Fach-Modus. In unseren Experimenten haben wir dieses Tor bei 0,3. Zellen mit einer Punktzahl von weniger als 0,3 wurden als Oberfläche gebundenen Partikel-positiven Zellen.
  11. Schließlich, um die Zellen mit Hintergrundmarkierung zu beseitigen und die spezifische internalisierten Nanopartikel oder Bakterien zu identifizieren, wurde die Anzahl IDEEN Landschaftliches Funktion verwendet. Landschaftliches Anzahl ist eine Funktion, die Anzahl der verbundenen Komponenten oder kleine Masken in einem Bild zählt. Die Maske Funktionen, Spot, Peak und Intensität wurden verwendet, um die Spots zu definieren. Der Spot Maske findet die helle Details in einem Bild, das eine vom Benutzer angegebene Radius und Schwellenwert, ab dem lokalen Hintergrund haben, wird die Maske durch Auseinanderbrechen hohen Intensitäten in einzelne Flecken mit der Peak-Funktion und dann Flecken oberhalb einer Intensität von 200 Zählungen verfeinert wurden eingeschlossen . Sehen Sie sich die Maskierung Amnis Spot Guide für weitere Informationen (1E). Eine Statistik re Port-Vorlage wurde von einschließlich verschiedener Funktionen im Menü Berichte generiert.
  12. Diese Datei gespeichert wurde, als Vorlage-Datei für Batch-Analyse aller experimentellen Dateien verwendet werden soll.
  13. In der IDEAS-Software, klicken Sie auf Extras → Batch-Input Data Files und alle. Rif Dateien. Fügen Sie den Ausgleich Matrix-Datei (. CTM) und die Template-Datei (. AST) in den entsprechenden Abschnitten. Reichen Sie die Batch-Verarbeitung. Nach dem Verarbeitungsschritt, werden alle. RIF-Dateien analysiert und. DAF-Dateien für jede der einzelnen RAW-Dateien generiert. Ein Abschlussbericht mit Statistik-Datei wird für alle Proben erzeugt.

Tipps & Hinweise:

  • Die Bildanalyse erfolgte unter Verwendung des IDEAS-Software Version 4.0 und die Internalisierung Assistenten mit einigen Änderungen. Der Assistent ist selbsterklärend und lehrreich die ouptput. DAF-Datei kann gemäß den Anweisungen des Assistenten generiert werden.

7. Repräsentative Ergebnisse

"> Die repräsentative Bilder in Abbildung 2 zeigen, dass MIFC verwendet werden, um erfolgreich zwischen verinnerlichten (links) im Vergleich zu unterscheiden Oberfläche gebundenen (rechtes Bild) NP (2A) oder Salmonellen (Abbildung 2B). Internalisierung von NP und Salmonellen wurden durch reduzierte sowohl Hemmung einer Aktin und Absenken der Temperatur auf 4 ° C (3A). Der Prozentsatz der Zellen positiv für Oberfläche gebunden NP von etwa 8% bei 37 ° C erhöht, um mehr als 35% nach entweder Cytochalasin D-oder 4 ° C Behandlung ( 3B). Im Gegensatz dazu der Anteil der Zellen mit der Oberfläche gebundenen Salmonella wurde von 35% bis 15% nach Cytochalasin D-Behandlung verringert. Inkubation der RAW 264.7-Zellen mit Salmonella bei 4 ° C verringert Internalisierung ohne offensichtliche Zunahme der Menge von Oberfläche gebunden Bakterien als die 37 ° C Kontrolle verglichen. Zusammen zeigen diese Daten, dass <em> Salmonellen und NP sind durch einen ähnlichen Prozess, der zellulären Aktin erfordert und ist temperaturabhängig verinnerlicht. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass bei einer nachhaltigen Befestigung von Salmonellen zu Makrophagen erfordert Aktin-Polymerisation.

1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Gating-Strategie genutzt werden, um festzustellen, verinnerlicht gegenüber Oberfläche gebundenen Nanopartikeln und Salmonellen. (A) Um die Analyse, um einzelne Zellen zu begrenzen, ist es wichtig, Schutt und mehrzelligen Ereignisse zu beseitigen. Einzelne Zellen und Dubletten wurden von mehrzelligen Aggregate mit dem IDEEN Funktionen an und das Seitenverhältnis des Hellfeldbild (M01) getrennt sind. Gebiet ist die Größe des Bildes in Quadratmikrometer und das Seitenverhältnis der Nebenachse von der Hauptachse und daher ein Maß für Zirkularität (ein perfekter Kreis wird ein Seitenverhältnis von 1 haben unterteilt; Dubletts typischerweise aspect Verhältnissen von etwa 0,5 und vielzelligen Aggregate sind in der Regel weniger als 0,5). Eine Region wurde auf Tor auf einzelne Zelle Ereignisse (Schritt 6.6) gezeichnet. (B) Zum Tor auf Zellen in-Fokus, verfügen die IDEEN RMS Gradient des Hellfeld-Bild in einem Histogramm dargestellt. Der Gradient RMS-Funktion misst die Schärfe Qualität eines Bildes durch Erfassen von Änderungen der Pixelwerte in dem Bild. Ein höherer Wert zeigt Gradient RMS einen stärker fokussierten Bild (Schritt 6.7). (C) Das grüne Leuchten positiven Zellen wurden durch Gating auf die Zellen mit hoher Max Pixelwerte und Intensität der grünen Fluoreszenz in Kanal (Schritt 6.8) ausgewählt. (D) Zellen mit internalisierten NP oder Salmonella wurden, indem die Zellpopulation mit einer Internalisierung des Gastes gleich oder größer als 0,3 gewählt. Zellen, die eine Punktezahl weniger als 0,3 wurden als Oberfläche gebunden (Schritt 6.9). (E) Zellen in der "internalisiert" Gate wurden weiter basierend auf der Anzahl von Punkten (NP oder STM), da dadurch there waren einige Zellen mit Hintergrundfärbung, die als verinnerlichte gezählt wurden, hatte aber einen Punkt den Wert Null (Schritt 6.11). Repräsentative Bilder werden für jedes Tor präsentiert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

2
Abbildung 2. Handy Bilder von verinnerlichten und Oberfläche gebundenen Nanopartikeln (NP) oder Salmonella. (A) Repräsentative Bilder RAW 264.7-Zellen, die verinnerlichte NP (linkes Bild) und Zellen, die auf NP wurden, um ihre Oberfläche gebunden, aber nicht internalisiert (rechtes Bild). (B) Repräsentative Bilder RAW 264.7-Zellen, die verinnerlichte Salmonella (linkes Bild) und Zellen, die auf Salmonellen wurden, um ihre Oberfläche gebunden, aber nicht internalisiert (rechtes Bild).

Abbildung 3
Abbildung 3. Cytochalasin-D-Behandlung der Zellen gehemmt Internalisierung von NP und Salmonellen. (A) Vorbehandlung von RAW 264.7 Zellen mit Cytochalasin-D oder Inkubation bei 4 ° C verringerte das Auftreten von NP oder Salmonella Internalisierung zu RAW 264.7-Zellen bei 37 ° C in einem Medium inkubiert verglichen. RAW 264.7-Zellen in Medium mit DMSO (dh Vehikelkontrolle) inkubiert zeigten ähnliche Internalisierung Ebenen für NP und Salmonella verglichen mit Medium allein (Daten nicht gezeigt). (B) Vorbehandlung von RAW 264.7 Zellen mit Cytochalasin-D erhöht den Prozentsatz an Zellen mit NP Oberfläche, während die Verringerung der Prozent der Zellen mit Oberflächen-gebundenen Salmonellen gebunden.

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Discussion

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Studien haben gezeigt, dass biologisch abbaubare Nanopartikel auf Basis von Poly (milchsäure-co-Glykolsäure (PLGA) oder Polyanhydriden verwendet werden, um eingeschlossene Antigene oder Medikamente Zielzellen abzugeben. Aufnahme dieser Nanopartikel von phagozytischen Zellen auf ihre Wirksamkeit wichtig, damit quantitative . Analyse der Internalisierung kritisch bei der Entwicklung neuartiger Nanopartikel-Delivery-Systeme Mit dieser Methode können differentielle Aufnahme von Nanopartikeln in verschiedenen Zelltypen mit Leichtigkeit analysiert, um Datum, konventionellen Mikroskopie und Durchflusszytometrie wurden zur Quantifizierung Partikelaufnahme verwendet worden sind;. jedoch ihre jeweiligen Einschränkungen mit hohem Durchsatz und Auflösung Ruf nach alternativen Ansätzen zur Internalisierung zu studieren. In diesem Artikel führen wir MIFC Analyse zu charakterisieren und zu vergleichen, wie der biologische Prozess der Phagozytose zwischen zwei Arten von Zielen ein bakterielles Pathogen-und synthetischen Nanopartikeln unterscheidet.

Die MIFC phagocytoswird Assay wurde verwendet, um Unterschiede in der Mechanismus der Aufnahme von Salmonella verglichen mit Nanopartikeln zu beschreiben. Es sei darauf hingewiesen, dass Inhibitoren können in Abhängigkeit von ihrer cytotoxischen Inkubationszeit und Konzentration werden, also eine vor Zytotoxizität Profilierung (dh, Belichtungszeit und Konzentration) vor ihrer Verwendung 13,14 erforderlich. Nach der chemischen Formulierung können Nanopartikel eine Glasübergangstemperatur (Tg = 13 ° C) unterhalb RT haben folglich bilden sie Aggregate auf RT 15. Um die Aggregation zu überwinden, beschallt wir die Teilchen und hielt sie auf Eis vor der Zugabe zu den Zellkulturen. Kinetische Untersuchungen von Nanopartikel-Aufnahme liefern wichtige Informationen über die Effizienz dieser Teilchen, die gekapselten Datenpakete auf Antigen-präsentierenden Zellen zu liefern. Es ist darauf zu Zellen auf Eis am Ende eines gegebenen Zeitpunkt zu halten, um weiter zu verhindern zelluläre Prozesse werden. Zu diesem Zweck haben wir festgestellt Variabilität cellular Aufnahme, wenn Zellen nicht auf Eis gelegt. Eine Einschränkung des oben beschriebenen Verfahrens ist, dass das Experiment auf adhärenten Zellen, die Schabtechniken um die phagozytischen Zellen zu ernten erforderlich durchgeführt wird. Dieses Verfahren könnte zum Zelltod führen, damit die Einführung einige Fehler in der Analyse der Daten. Das Verfahren beschreiben wir hier könnte auch unter Verwendung von Zellen, die in Suspension wachsen werden.

Die Inkubation von Makrophagen, die mit Reaktivfarbstoffen oder Immunmarkierung Reagenzien wurde durch Reduktion der Menge des restlichen Puffer vorhanden folgenden Fixierung optimiert. Die Anwesenheit von Rest-Puffer erzeugt einen Verdünnungseffekt und Probe zu Probe Variation unter den mehreren Abtastungen zu erzeugen, was zu inkonsistenten mittleren Fluoreszenzintensität Werte. Probenkonzentration (dh Zellen / ml) ist ebenfalls ein wichtiger Faktor, um bei der Akquisition Schritt betrachten, als verdünnte Proben führen zu längeren Laufzeiten. Eine Multi-Parameter-Vergleich zwischen verschiedenenVersuchsproben, ist es wichtig, dass die Laserintensität konstant.

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Disclosures

Sherree L. Freund wird von Amnis Corporation, die das System produziert ImageStream X beschäftigt.

Acknowledgments

Die Autoren möchten die ONR-Muri Award (NN00014-06-1-1176) und das US Army Medical Research und Materiel Command (Grant Numbers W81XWH-09-1 bis 0386 und W81XWH-10-1-0806) für die finanzielle danken zu unterstützen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RAW 264.7 cell line American Type Culture Collection (ATCC) TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cellgro 10-013-CV
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S 11150 Premium Grade
Glutamax GIBCO, by Life Technologies 35050-061
HEPES GIBCO, by Life Technologies 15630-080
24-well plate Techno Plastic Products 92024
Cell culture Flasks Techno Plastic Products 90151
Cell scraper Techno Plastic Products 99002 24 cm
Salmonella entericaserovar Typhimurium ATCC 14028
BTX ECM630 Electro Cell Manipulator BTX Technologies
MOPS Fisher Scientific BP308
Phosphate buffered saline (PBS) Cellgro 21-040-CV
Ultrasonic liquid processor Misonix S-4000
Cytochalasin-D Sigma-Aldrich, C8273
Formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Wash buffer 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS.
Perm/wash buffer BD Biosciences 554714
Clear-view snap cap microtubes Sigma-Aldrich T4816
Alexa Fluor phalloidin 660 Invitrogen A22285
ImageStreamX Amnis Corporation 100200 Options: 658nm laser, autosampler
Sodium azide Fisher Scientific S 227I-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
  2. Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
  3. Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
  4. Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
  5. Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
  6. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
  7. Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
  8. Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
  9. Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
  10. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
  11. Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
  12. Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
  13. Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
  14. Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
  15. Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie
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Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., Phillips, G. J., Narasimhan, B., Wannemuehler, M. J., Bellaire, B. H. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884, doi:10.3791/3884 (2012).More

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