במאמר זה, אנו מתארים את שיטת ניצול רב רפאים זרימת cytometry הדמיה לכמת את ההפנמה של חלקיקים polyanhydride או חיידקים של 264.7 תאים הגלם.
מערכות nanoparticulate התפתחו כמו כלים יקרי ערך במתן חיסון דרך יכולתם יעיל לספק המטען, כולל חלבונים, לתאים מציגי אנטיגן 1-5. ההפנמה של חלקיקים (NP) על ידי תאים מציגי אנטיגן הוא שלב קריטי ביצירת תגובה חיסונית יעילה אנטיגן כמוס. כדי לקבוע כיצד שינויים בתפקוד ניסוח nanoparticle השפעה, ביקשנו לפתח קצב העברת נתונים גבוה, פרוטוקול הניסוי הכמותי שהיה תואם גילוי חלקיקים פנימיים כמו גם חיידקים. נכון להיום, שתי טכניקות עצמאיות, מיקרוסקופיה cytometry זרימה, היו האמצעים שננקטו כדי ללמוד phagocytosis של חלקיקים. טבע קצב העברת נתונים גבוה של זרימת cytometry מפיק נתונים סטטיסטיים חזקים. עם זאת, בשל ברזולוציה נמוכה, הוא אינו מדויק לכמת הפנימו לעומת חלקיקים הנכנס סלולריים. מיקרוסקופיה מייצר תמונות עם רזולוציה מרחבית גבוהה, However, זה זמן רב וכרוכה גודל מדגם קטן 6-8. רב רפאים הדמיה תזרים cytometry (MIFC) היא טכנולוגיה חדשה המשלבת היבטים של מיקרוסקופיה והן cytometry זרימה שמבצע רב בתחום ספקטרלי צבע דימות פלואורסצנטי ובהיר בו זמנית דרך הליבה למינרית. יכולת זו מספקת ניתוח מדויק של עוצמת אות ניאון ומערכות יחסים מרחביים בין מבנים שונים ותכונות סלולריות במהירות גבוהה.
במסמך זה אנו מתארים שיטת ניצול MIFC לאפיין את אוכלוסיות תאים אשר הפנימו חלקיקים polyanhydride או סלמונלה enterica serovar Typhimurium. כמו כן, אנו מתארים את הכנת תרחיפים nanoparticle, תיוג התא, רכישת במערכת ImageStream X וניתוח של נתונים באמצעות יישום רעיונות. יש לנו גם להדגים את היישום של השיטה, שניתן להשתמש בהם כדי להבדיל עמ 'הפנמהathways עבור חלקיקים וחיידקים באמצעות cytochalasin-D כמעכב של phagocytosis אקטין בתיווך.
מחקרים הראו כי חלקיקים מתכלה על בסיס חומצה פולי לקטית-Co-גליקולית ((PLGA) או polyanhydrides ניתן להשתמש כדי לספק אנטיגנים כמוס או תרופות לתאי מטרה. הספיגה של חלקיקים אלה על ידי תאים phagocytic חשוב האפקטיביות שלהם, ובכך כמותית . ניתוח של הפנמה קריטי בעיצוב nanoparticle הרומן מערכות אספקת י?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות פרס ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) של צבא ארה"ב למחקר רפואי ואמצעי פיקוד (במדבר גרנט W81XWH-09-1-0386 ו W81XWH-10-1-0806) עבור כספי תומכים.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
24-well plate | TPP | 92024 | |
Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |