Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

doi: 10.3791/3884 Published: June 8, 2012

Summary

במאמר זה, אנו מתארים את שיטת ניצול רב רפאים זרימת cytometry הדמיה לכמת את ההפנמה של חלקיקים polyanhydride או חיידקים של 264.7 תאים הגלם.

Abstract

מערכות nanoparticulate התפתחו כמו כלים יקרי ערך במתן חיסון דרך יכולתם יעיל לספק המטען, כולל חלבונים, לתאים מציגי אנטיגן 1-5. ההפנמה של חלקיקים (NP) על ידי תאים מציגי אנטיגן הוא שלב קריטי ביצירת תגובה חיסונית יעילה אנטיגן כמוס. כדי לקבוע כיצד שינויים בתפקוד ניסוח nanoparticle השפעה, ביקשנו לפתח קצב העברת נתונים גבוה, פרוטוקול הניסוי הכמותי שהיה תואם גילוי חלקיקים פנימיים כמו גם חיידקים. נכון להיום, שתי טכניקות עצמאיות, מיקרוסקופיה cytometry זרימה, היו האמצעים שננקטו כדי ללמוד phagocytosis של חלקיקים. טבע קצב העברת נתונים גבוה של זרימת cytometry מפיק נתונים סטטיסטיים חזקים. עם זאת, בשל ברזולוציה נמוכה, הוא אינו מדויק לכמת הפנימו לעומת חלקיקים הנכנס סלולריים. מיקרוסקופיה מייצר תמונות עם רזולוציה מרחבית גבוהה, However, זה זמן רב וכרוכה גודל מדגם קטן 6-8. רב רפאים הדמיה תזרים cytometry (MIFC) היא טכנולוגיה חדשה המשלבת היבטים של מיקרוסקופיה והן cytometry זרימה שמבצע רב בתחום ספקטרלי צבע דימות פלואורסצנטי ובהיר בו זמנית דרך הליבה למינרית. יכולת זו מספקת ניתוח מדויק של עוצמת אות ניאון ומערכות יחסים מרחביים בין מבנים שונים ותכונות סלולריות במהירות גבוהה.

במסמך זה אנו מתארים שיטת ניצול MIFC לאפיין את אוכלוסיות תאים אשר הפנימו חלקיקים polyanhydride או סלמונלה enterica serovar Typhimurium. כמו כן, אנו מתארים את הכנת תרחיפים nanoparticle, תיוג התא, רכישת במערכת ImageStream X וניתוח של נתונים באמצעות יישום רעיונות. יש לנו גם להדגים את היישום של השיטה, שניתן להשתמש בהם כדי להבדיל עמ 'הפנמהathways עבור חלקיקים וחיידקים באמצעות cytochalasin-D כמעכב של phagocytosis אקטין בתיווך.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. תא RAW 264.7 תרבות

  1. הגלם קציר 264.7 תאים צלוחיות שלהם כאשר הם מגיעים confluency ידי גירוד אותם בעדינות עם מגרד התא. הרוזן ואת צלחת אותם מנה 24 גם תא התרבות בצפיפות של 5 x 10 5 תאים / גם ב 0.5 בינוני מלא מ"ל שינוי הנשר של Dulbecco (cDMEM: 10% חום מומת בסרום שור עוברית (FBS), 2 מ"מ Glutamax, ו 10 מ"מ) HEPES דגירה של לילה ב 37 מעלות 5% CO 2 באינקובטור.

2. סלמונלה פתוגניים enterica Serovar Typhimurium 14028 טרנספורמציה והתרבות

  1. להציג רקומביננטי פלסמידים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ל-S. Typhimurium ידי electroporation. ראשית, להכין את התרבות של סלמונלה enterica serovar Typhimurium (ATCC 14028) במרק LB ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם אוורור.
  2. למחרת, 1 מ"ל גלולה של חיידקים במהירות מרבית microcentrifuge. שוטפים את התאים FOפעמים ur עם 1 מ"ל של מגבים קרים / פתרון גליצרול (1 מ"מ 3 - (N-morpholino) propanesulfonic חומצה (מגבים) חיץ גליצרול 20%) על ידי בעדינות resuspending גלולה עם פיפטה בין לשטוף כל 9. לאחר שטיפה של דבר, resuspend גלולה ב 50 μL של מגבים / וגליצרול שלתוכו ~~~V~~HEAD=NNS 0.5 מיקרוגרם של ה-DNA pAKgfp1 או pAKgfplux1 פלסמיד נמחקה 10.
  3. מעבירים את ההשעיה התא מראש צונן 1 קובט הפער מ"מ electroporation ו electroporate תוך שימוש בהגדרות: 1800 200 V, W, 25 MF. מיד לאחר הלידה הדופק, הוסף 1 מ"ל של מרק LB ולהעביר את ההשעיה לתא צינור חדש של 15 מ"ל. אפשר התאים להתאושש על 37 מעלות צלזיוס עם אוורור. לאחר שעה, לרכז את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend ב μL 100 ~ של supernatant הנותרים.
  4. לבסוף, צלחת התאים על צלחות ליברות המכילות 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו ampicillin דגירה לילה ב 37 מעלות C. מושבות יחיד הם מטוהרים על ידי restreaking עם מבחר ביטוי אנטיביוטיקה ו-GFP אניזה אושר על ידי תאורה עם isothiocyanate fluorescein סטנדרטי (FITC) מערכת הסינון.
  5. לחסן 10 מ"ל של מרק LB המכיל 25 מיקרוגרם / מ"ל ampicillin (או אנטיביוטיקה המתאימה) עם loopful של סלמונלה כי הפך ל-GFP אקספרס ביציבות.
  6. לגדל את החיידקים למשך הלילה ב 37 ° C.
  7. לדלל 1:10 סלמונלה לתוך צינור תרבות חדשה המכילה 10 מ"ל LB השלימו עם ampicillin ו דגירה של 5 שעות ב 37 ° C.
  8. למדוד את ספיגת התרבות על 600 ננומטר ולחשב את ריכוז סלמונלה לכל מ"ל באמצעות בעבר להקים עקומת גדילה.
  9. לדלל את סלמונלה cDMEM (0.5 מ"ל / גם) כדי להשיג ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 100 לכל תא 264.7 RAW.

3. הכנת תרחיף Nanoparticle

  1. לפברק 1% FITC חלקיקים טעונים כפי שתואר קודם 11. בקיצור, החלקיקים מיוצרים על ידי polyanhydrideנגד ממס nanoencapsulation, בו הפולימר הוא מומס מתילן כלוריד (4 ° C בריכוז של 25 מ"ג / מ"ל) ו זירז של פנטן (ב -30 ° C כלוריד 1:200 יחס מתילן: פנטן). שחזור על ידי סינון חלקיקים אבק. לאחר מתאדים כל ממס שיורי, לשקול את polyanhydride יבשים חלקיקים באמצעות עיקור לשקול נייר.
  2. הוסף 5 מ"ג של חלקיקים 0.5 מ"ל של פוספט קר בופר סליין (PBS, סידן ומגנזיום בחינם, pH 7.4) על צינור 1.5 microcentrifuge מ"ל ולשמור על הקרח עד חלקיקים נוספים על 264.7 תאים הגלם.
  3. Sonicate ההשעיה nanoparticle (תוך שמירה על קרח) באמצעות מעבד נוזל קולי מצויד microtip על של כ 25 על 4 עד 6 ג'ול.

4. Phagocytosis Assay

  1. Pretreat משנה של 264.7 תאים גלם עם 5 מיקרוגרם / מ"ל cytochalasin-D 1 שעות לפני השקת NP או סלמונלה ידי aspirating בינוני replacing עם cDMEM טרי השלים עם מעכב. להחזיר את התרבויות עד 37 ° C חממה.
  2. לאחר דגירה H 1 עם מעכב, להסיר את הצלחות מן האינקובטור, מערבולת ההשעיה nanoparticle, ולהוסיף 10 μL על בארות המתאימים.
  3. המערבולת סלמונלה ו להדביק את הגלם 264.7 תאים עם משרד הפנים של 100 על ידי הוספת חיידקים בארות המתאימים.
  4. הקש את צלחת כמה פעמים כדי לערבב דגירה על 37 מעלות צלזיוס או 4 ° C (שליטה) על 45 דקות.
  5. הסר את הלוחות של חממה או המקרר ומניחים על קרח. שוטפים את התאים פעמיים עם קרח קר PBS (ללא Ca 2 + ו - Mg 2 +) על ידי aspirating ולהשאיר את המדיום הישן להסיר חלקיקים מאוגד, סלמונלה, או מתים או מנותקת הגלם 264.7 תאים.
  6. למסוק את הגלם 264.7 תאים לאחר שטיפה 2, להוסיף 250 μL של קר כקרח PBS ובעדינות לגרד את הבארות.
  7. Pipet התאים שנקטפו לתוך תצוגה ברורה, הצמד שווי מיקרוסרכזת צינורות ולשמור אותם על הקרח.
  8. שוטפים את התאים על ידי הוספת 1 ​​מ"ל של חיץ לשטוף קר (FBS חום 2% מומת, אזיד הנתרן 0.1% ב PBS) וכן צנטריפוגה ב 250 x 10 גרם דקות ב 4 ° C.
  9. מחק supernatant ולהסיר חיץ שיורי על ידי הקשה על צינור microcentrifuge הפוך על מגבת נייר. Resuspend תא גלולה ידי בעדינות וגרף צינור microcentrifuge על המדף מבחנה.
  10. לתקן את הגלם 264.7 תאים על ידי הוספת 100 μL של paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS ולאפשר התאים לעמוד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  11. לשטוף את הגלם 264.7 תאים על ידי הוספת 1 ​​מ"ל של חיץ פרם / Wash (BD Biosciences) ו צנטריפוגות ב 250 x 10 גרם דקות ב 4 ° C.
  12. חזור על שלב 4.9.
  13. כתם הגלם 264.7 תאים עבור אקטין על ידי הוספת 100 μl של חיץ פרם / Wash המכילה פלואוריד Alexa phalloidin 660 (AF 660, 1:150 דילול) במשך 15 דקות ב RT. חזור על שלבים 4.11 ו 4.12.
  14. Resuspend הגלם 264.7 תאים μL 50 שלPBS המכיל 1% PFA ולאחסן אותם בחושך ב 4 ° C עד הרכישה.

טיפים והערות:

  • בית הקרינה דגימות צבע צריך להיות מוכן בשלב זה כדי לשמש פיצוי בקרות במהלך הגדרת מכשיר X ImageStream. פיצוי שולט כלל בניסוי זה היו: גלם 264.7 תאים (לא מסומן על אקטין) מודגרות עם חלקיקים; הגלם 264.7 תאים (לא מסומן על אקטין) מודגרות עם סלמונלה, אקטין שכותרתו רק הגלם 264.7 תאים.
  • עבור מחקרים מעכב, חשוב לכלול את השליטה ברכב שבו מעכב פורקה כביקורת. בניסוי זה, cytochalasin-D פורקה ב DMSO 100%. אנו, אם כן, תאים מודגרות ב cDMEM המכיל DMSO ולאחר מכן העריכו את ההפנמה של חלקיקים או סלמונלה. לא גילינו שום הבדל משמעותי בין קבוצה בינונית DMSO הביקורת (מידע לא מוצג).
  • SAמדריך הכנה mple באתר האינטרנט Amnis ( https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf ) הוא משאב טוב לבדוק את התאימות של fluorophores עם X ImageStream. כדי לגשת למסמך זה, על המשתמשים להירשם תחילה (בחינם של תשלום) עם איימיס.

5. לדוגמא רכישה על X ImageStream

  1. לשלטון את ImageStream X ו ההשקה השראה.
  2. אתחול fluidics. בסוף זה SpeedBeads סקריפט צריך לפעול.
  3. בתפריט קובץ, בחר טען תבנית ברירת המחדל.
  4. בשנת התפריט גלריית תמונות נוף, בחר הכול, לחץ להפעיל את תוכנית ההתקנה כדי להתחיל הדמיה את החרוזים.
  5. התאם Core מעקב תמונות מרכז רוחבית (במידת הצורך).
  6. בחר את הערוץ (BF) brightfield ולחץ על עצמה סט.
  7. המתן עד קורות חיים מהירות זרימה הוא עקבי leאס מ 0.2%.
  8. לכייל את המכשיר מדי יום. בכרטיסייה לסייע, לחץ על התחל כל לרוץ כיולים ובדיקות ולוודא שכל עברו.
  9. לחץ נעל טען פלאש ו - (FLL) כדי לטעון את המדגם 1. טען המדגם הבהיר בניסוי זה מאיר עם כל fluorochrome בשימוש. זה קריטי, כי אתה מפעיל את המדגם 1 כדי לקבוע את הגדרות המכשיר ולאחר מכן אל תשנו להם על הניסוי כולו.
  10. הפעל את הלייזר כל שימוש בניסוי ולהגדיר את כוח לייזר כך fluorochrome לכל ערכי מקסימום פיקסל בין 100 ל 4000 נחשב, כפי שהיא נמדדת החלקות להתפזר.
  11. הגדרת סיווג קריטריונים סלולריים, לחסל אוסף של אובייקטים לא רצויים. לאיסוף נתונים רק בתאים, בחר לצמצם את השטחים תחתון בערוץ BF ל -50 מיקרומטר. אובייקטים בשטח פחות מ 50 מיקרומטר ייחשב פסולת ולא יירכשו. בחר ערוצי להיות שנאספו.
  12. הזן את שם הקובץ, תיקיית היעד, רצף מוגדר# עד 1 ומספר אירועים לרכוש.
  13. לחץ על הפעלה רוכשת לאסוף ולשמור את קובץ הנתונים בניסוי 1.
  14. לחץ FLL ולהפעיל את מדגם הניסוי הבא. חזור על הפעולה עד שכל דגימות הניסוי כבר נאספו.
  15. לחץ על הגדרות comp (מכבה brightfield לייזר פיזור ומאפשר אוסף של כל הערוצים) ולאסוף 500 תאים חיוביים מכל מדגם צבעונית אחת עבור fluorophore כל בניסוי לפתח מטריקס פיצויים.

לסיכום, דוגמאות ניתן להפעיל לפי הסדר הבא:

  • המדגם הבהיר 1.
  • בדיקת דגימות הנותרים.
  • פיצוי שולט המכיל צבע פלואורסצנטי אחת.

טיפים והערות:

  • תבנית עודד ניתן לשמור מחדש כדי לקבוע את הגדרות המכשיר. לאחר נשמרות תבניות, autosampler ניתן להשתמש לפעולה ללא השגחה כדי להפעיל את הדוגמאות ניסויים עם תבנית אחת, ואת שיתוףmpensation שולט עם תבנית עבור כל פקד צבע אחד.
  • X ImageStream תצורה עבור ניסויים אלו: 488 ו 658 עירור לייזרים ננומטר, 785 ננומטר פיזור לייזר, המטרה 40X (0.75 NA), 6 מערכת הערוץ עם מחסנית ISX תקן הסינון. אפשרות autosampler שימש כדי לאפשר רכישה ללא השגחה של הדגימות.
  • ההגדרות הבאות שימשו לניסוי. חלקיקים הם צילמו עם לייזר 488 ננומטר מוגדר 10mW, לייזר 658 ננומטר מוגדר mW 50, לייזר 785 ננומטר מוגדר 2 mW ו BF בערוץ 1. תאים נגועים סלמונלה הם צילמו עם לייזר 488 ננומטר מוגדר mW 20, 658 ננומטר לייזר מוגדר mW 50, קבע את 785 ננומטר לייזר 2 mW, ו BF בערוץ 1. בקרות פיצויים נאספו בהעדר BF ו 785. לפחות 5,000 אירועים (כלומר, תאים) הם צילמו עבור כל אחד דגימות הבדיקה.

6. ניתוח תמונה

  1. הפעל רעיונות לחיצה כפולה על אשף הפנמה העומס עלהדואר של מדגם הבדיקה. קבצים הרי"ף.
  2. צור מטריצה ​​פיצויים על ידי לחיצה על 'מטריקס חדש' בשלב 2. אשף פיצוי הוא הושק. הוסף קבצים עבור הפקדים צבע יחיד בניסוי. לחץ על הבא האשף לאחר כיוונים עד הקובץ מטריקס פיצוי נשמר וטעון בתיבה בשלב 2 של האשף הפנמה.
  3. לחץ על הבא ועקוב אחר ההוראות עד הקובץ. דף שנוצר.
  4. הגדרת מאפייני תצוגת התמונה על ידי בחירת ערוצי תמונות נעשה שימוש במהלך הרכישה. לחץ על פרק 2 (FITC) ו-CH 5 (AF 660). (BF ו SSC הם ברירת המחדל שנבחרה).
  5. בחר ערוץ תמונה להכנת גבול התא (CH01) ואת הערוץ שבו חלקיקים או חיידקים נאספו (CH02).
  6. העלילה פיזור של brightfield שטח לעומת יחס הממדים brightfield של כל התאים נוצרת. להגדיר את אוכלוסיית תא בודד על ידי לחיצה על נקודות בודדות gating ברחבי singlets. תאים בודדים יש יחס שלסיבוב 1 ו כפילויות סביב 0.5 (איור 1 א).
  7. היסטוגרמה של שורש צבע brightfield ממוצע ריבוע (RMS) של התמונה brightfield נוצר והנוף האוכלוסייה בגלריה את התמונה מוגדר בן נבחרה (1B איור). לחץ על פחי כדי לקבוע היכן התאים המיקוד הטוב ביותר להתחיל ולצייר באזור קו לתאי השער ממוקדים. יותר צבע RMS, יותר טוב וממוקד. לדלג על השלב הבא, אלא אם כן יש כתמים אחרים שאתה רוצה על השער.
  8. העלילה פיזור חדש של אינטנסיביות של ערוץ 2 על פיקסל ציר x לעומת מקס של CH2 על ציר ה-Y נוצר (איור 1 ג). לחץ על הנקודות ולהציג את התמונות כדי לעזור לכם לצייר את האזור סביב התאים, כי הם חיוביים עבור חלקיקים או חיידקים.
  9. היסטוגרמה של תכונה הפנמה נוצר עם האזור הזה מתחיל ב 0, שאמור להיות מותאם על ידי התבוננות בתמונות (1D איור). תכונה הפנמה הוא היחס ביןעוצמה בתוך התא לעוצמת התא כולו. זה ישתנה כך לפי שווי של 0 כמחצית עוצמת נמצאת בישוב. אשף יצרה באזור לציין בתוך ידי יצירת מסכה כי השתמשה קלט התמונה התא משלב 5 כדי למצוא את פני השטח של התא נשחק את זה על ידי 4 פיקסלים. שים לב, זו המסכה ניתן לשנות באופן ידני על תאים מסוגים שונים בעת הצורך. בניסוי זה, אנו להתאימם באופן ידני את התכונה על ידי יצירת אובייקט המסכה על התמונה brightfield הראשון נשחק את זה על ידי 4 פיקסלים. תכונה הפנמה חושב אז על זה מסכת 4 אובייקט שחוק פיקסל. תכונה זו מאפשרת לנו להבחין בין חלקיקים מופנמים וחיידקים, אשר יש רוב האות הקרינה שלהם בתוך גבולות המסכה, מן השטח חלקיקים וחיידקים הנכנס, שבה יש רוב אותות הקרינה שלהם מחוץ לגבול המסכה (איור 2).
  10. יצירת היסטוגרמה חדשה עם הפנמה חדשה FEAture מבוסס על מסכת אובייקט השחוקה. צייר באזור לשער על תאים פנימיים על ידי הצגת תמונות במצב בן הנבחרת. בניסויים שלנו, אנו קובעים את השער על 0.3. תאים עם ציון נמוך יותר מ -0.3 נחשבו קשורות פני החלקיקים תאים חיוביים.
  11. לבסוף, כדי לחסל את התאים עם תיוג רקע לזהות חלקיקים פנימיים ספציפיים או חיידקים, הרעיונות Count תכונה ספוט היה בשימוש. ספירת במקום היא תכונה סופר את מספר הרכיבים המחוברים או מסיכות קטנות בתמונה. תפקידי המסכה, נקודה, שיא ועוצמת שימשו להגדיר את הנקודות. המסכה מקום מוצא את הפרטים בהירים בתמונה כי יש רדיוס המשתמש שצוין לעיל ועל סף רקע מקומי, את המסכה הוא מעודן ידי מתפרקת עוצמות גבוהות אל מקומות מסוימים באמצעות פונקציית שיא ואז נקודות מעל בעוצמה של 200 סעיפים נכללו . לראות את המקום Amnis מיסוך מדריך למידע נוסף (איור 1E). Re לסטטיסטיקה תבנית הנמל נוצר על ידי הוספת תכונות שונות בתפריט דוחות.
  12. קובץ זה נשמר כקובץ תבנית לשמש לניתוח אצווה של כל הקבצים ניסיוניים.
  13. בתוכנה רעיונות, לחץ על כלים אחרון אצווה קבצי נתונים ו קלט את כל קבצי הרי"ף. מוסיפים את מטריקס פיצוי הקובץ (. CTM) ואת קובץ תבנית (. AST) בסעיפים המתאימים. שלח אצווה לעיבוד. לאחר שלב עיבוד, את כל הקבצים. RIF הם נותחו. קבצים daf נוצרות עבור כל אחד מהקבצים גלם בודדים. קובץ הדו"ח הסופי נוצר עם נתונים סטטיסטיים עבור כל הדגימות.

טיפים והערות:

  • ניתוח התמונה בוצעה באמצעות הרעיונות גרסת תוכנה 4.0 ו אשף הפנמה עם כמה שינויים. אשף עצמית מאלפת את הקובץ. Ouptput דף יכול להיווצר על ידי ביצוע ההוראות של האשף.

7. נציג תוצאות

"> התמונות נציג באיור 2 מראים כי MIFC יכול לשמש בהצלחה להבחין בין (פאנל משמאל) מופנמת מול פני הנכנס (פאנל מימין) NP (איור 2 א) או סלמונלה (איור 2 ב). הפנמה של NP ו סלמונלה הופחתו גם אקטין עיכוב והורדת הטמפרטורה עד 4 ° C (איור 3 א). אחוז התאים החיוביים של פני השטח חייב NP גדל ב 37 ° C מ כ -8% עד 35% יותר מאשר לאחר טיפול או cytochalasin-D או 4 ° C ( איור 3 ב). לעומת זאת, אחוז תאים עם סלמונלה פני הנכנס ירד מ 35% עד 15% לאחר הטיפול cytochalasin-D. הדגירה של 264.7 תאים גלם עם סלמונלה ב 4 ° C הפנמה ירידה ללא עלייה ניכרת בסך של השטח חייב חיידקים לעומת 37 ° C שליטה. יחד, נתונים אלה מראים כי <em> סלמונלה ו NP הן הפנימו בתהליך התאי דומה הדורש אקטין תלויה בטמפרטורה. יתר על כן, הנתונים מצביעים על כך מצורף מתמשכת של סלמונלה כדי מקרופאגים דורש פילמור אקטין.

איור 1
באיור 1. סכמטי של האסטרטגיה gating מנוצל כדי לקבוע הפנימו לעומת חלקיקים פני הנכנס ו סלמונלה. (א) כדי להגביל את הניתוח לתאים בודדים, חשוב לסלק פסולת ורב תאיים אירועים. תאים בודדים ו כפילויות הופרדו אגרגטים תאיים באמצעות הרעיונות תכונות השטח יחס הממדים של התמונה brightfield (M01). האזור הוא בגודל של התמונה ב מיקרון מרובע ו יחס הממדים הוא ציר הקטין חלקי ציר מרכזי ולכן מידה של מעגליות (עיגול מושלם יהיה יחס של 1: בדרך כלל יש כפילויות aspeיחסי CT של סביב 0.5 אגרגטים תאיים הם בדרך כלל פחות מ 0.5). האזור נמשך אל השער על אירועים תא בודד (שלב 6.6). (ב) על השער התאים פוקוס, הרעיונות תכונה צבע RMS של התמונה brightfield הוא להתוות היסטוגרמה. תכונה RMS צבע מודד את איכות החדות של התמונה על ידי איתור שינויים של ערכי פיקסלים בתמונה. ערך גבוה יותר RMS צבע עולה תמונה ממוקדת יותר (שלב 6.7). (ג) גרין תאים חיוביים הקרינה שנבחרו על ידי gating על תאים עם ערכים גבוהים מקס פיקסל ועוצמת בערוץ פלואורסצנטי ירוק (שלב 6.8). (ד) תאים עם NP סלמונלה מופנמת או נבחרו על ידי בחירת אוכלוסיית תאים עם ציון הפנמה שווה או גדול מ -0.3. תאים שקיבלו ציון פחות מ 0.3 נחשבו לפני השטח חייב (שלב 6.9). (ה) תאים את השער "מופנמת" התאפיינו נוספת המבוססת על מספר נקודות (NP או STM) כי יסהדואר היו כמה תאים עם רקע מכתים, נספרים כמו מופנמת אבל היה ערך נקודה של אפס (שלב 6.11). תמונות מייצגות מוצגים שער כל אחד. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 2
איור 2. התא תמונות של חלקיקים הנכנס מופנמים משטח (NP) או סלמונלה. (א) נציג תמונות של 264.7 תאים הגלם NP מופנמת (פאנל משמאל) תאים שאליהם NP היו קשורות לפני השטח שלהם, אבל לא מופנמת (פאנל מימין). (ב) נציג תמונות של 264.7 תאים הגלם סלמונלה מופנמת (פאנל משמאל) תאים שאליהם סלמונלה היו קשורות לפני השטח שלהם, אבל לא מופנמת (פאנל מימין).

איור 3
איור 3. CytochalaD-החטא טיפול בתאי עכבות הפנמה של NP ו סלמונלה. () Pretreatment של 264.7 תאים גלם עם cytochalasin-D או דגירה על 4 ° C הפחית את השכיחות של הפנמה NP או סלמונלה, לעומת 264.7 תאים הגלם מודגרות על 37 מעלות צלזיוס בכל מדיום. הגלם 264.7 תאים מודגרות במדיום המכיל DMSO (כלומר, רכב שליטה) הראו רמות דומות של הפנמה NP ו סלמונלה לעומת בינוני בלבד (מידע לא מוצג). (ב) Pretreatment של 264.7 תאים גלם עם cytochalasin-D העלו את אחוז התאים עם משטח חייב NP תוך הפחתת אחוז התאים עם סלמונלה פני השטח מאוגד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחקרים הראו כי חלקיקים מתכלה על בסיס חומצה פולי לקטית-Co-גליקולית ((PLGA) או polyanhydrides ניתן להשתמש כדי לספק אנטיגנים כמוס או תרופות לתאי מטרה. הספיגה של חלקיקים אלה על ידי תאים phagocytic חשוב האפקטיביות שלהם, ובכך כמותית . ניתוח של הפנמה קריטי בעיצוב nanoparticle הרומן מערכות אספקת ידי שימוש בשיטה זו, ספיגת ההפרש של חלקיקים על ידי סוגי תאים שונים ניתן לנתח בקלות עד כה, מיקרוסקופיה קונבנציונאלי cytometry זרימת שימשו לכימות ספיגת החלקיקים,. עם זאת, כל אחד מהם מגבלות עם תפוקה גבוהה שיחת ברזולוציה של גישות חלופיות ללמוד הפנמה. במאמר זה, אנו מבצעים ניתוח MIFC לאפיין ולהשוות איך התהליך הביולוגי של phagocytosis שונה בין שני סוגים של מטרות-A חלקיקים הפתוגן סינתטי חיידקים.

MIFC phagocytosהוא שימש assay להתוות הבדלים שבבסיס המנגנון של ספיגת סלמונלה לעומת חלקיקים. יש לציין כי מעכבי יכול להיות ציטוטוקסיות בהתאם לזמן הדגירה שלהם וריכוז, ולכן פרופיל cytotoxicity לפני (כלומר, זמן החשיפה וריכוז) הוא הכרחי לפני השימוש בהם 13,14. בהתאם ניסוח הכימי שלהם, חלקיקים יכולים להיות המעבר זכוכית הטמפרטורה (TG = 13 ° C) מתחת RT, וכתוצאה מכך, הם יוצרים אגרגטים ב RT 15. כדי להתגבר על צבירה, אנו sonicated חלקיקים ושמר אותם על הקרח לפני כן על תרביות תאים. מחקרים הקינטית של ספיגת nanoparticle לספק מידע חשוב על היעילות של החלקיקים הללו כדי לספק מטען במארז לתאים מציגי אנטיגן. יש להקפיד לשמור על התאים על הקרח בסוף נקודת זמן ניתן לעכב עוד יותר תהליכים תאיים. לשם כך, שציינו משונות cellulaספיגת r כאשר תאים לא הונחו על הקרח. מגבלה אחת של השיטה המתוארת לעיל היא כי הניסוי מתבצע על תאים חסיד שדורשים גירוד טכניקות למסוק את התאים phagocytic. הליך זה עלול לגרום מוות של תאים, ובכך מציגה איזו שגיאה בניתוח הנתונים. ההליך המתואר לעיל יכול להתבצע גם באמצעות תאים הגדלים ההשעיה.

הדגירה של מקרופאגים עם צבעים תגובתי או ריאגנטים immunolabeling היה מותאם על ידי הפחתת כמות קיבעון שיורית המאגר הנוכחי הבאה. הנוכחות של חיץ שיורית יוצר אפקט דילול והוא יכול לייצר מדגם לשונות המדגם בין דוגמאות רבות, ובכך וכתוצאה מכך מתכוון ערכים שאינם עולים בקנה אחד בעוצמה פלואורסצנטי. ריכוז המדגם (כלומר, תאים למ"ל) היא גם גורם חשוב לשקול במהלך שלב הרכישה, כתוצאה דגימות לדלל בזמנים לרוץ זמן רב יותר. לשם השוואה רב פרמטרית בין אחרתדגימות הניסוי, חשוב לשמור על עוצמת הלייזר קבוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לחבר Sherree ל מועסק על ידי Amnis Corporation, המייצרת את מערכת X ImageStream.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות פרס ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) של צבא ארה"ב למחקר רפואי ואמצעי פיקוד (במדבר גרנט W81XWH-09-1-0386 ו W81XWH-10-1-0806) עבור כספי תומכים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RAW 264.7 cell line American Type Culture Collection (ATCC) TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cellgro 10-013-CV
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S 11150 Premium Grade
Glutamax GIBCO, by Life Technologies 35050-061
HEPES GIBCO, by Life Technologies 15630-080
24-well plate Techno Plastic Products 92024
Cell culture Flasks Techno Plastic Products 90151
Cell scraper Techno Plastic Products 99002 24 cm
Salmonella entericaserovar Typhimurium ATCC 14028
BTX ECM630 Electro Cell Manipulator BTX Technologies
MOPS Fisher Scientific BP308
Phosphate buffered saline (PBS) Cellgro 21-040-CV
Ultrasonic liquid processor Misonix S-4000
Cytochalasin-D Sigma-Aldrich, C8273
Formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Wash buffer 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS.
Perm/wash buffer BD Biosciences 554714
Clear-view snap cap microtubes Sigma-Aldrich T4816
Alexa Fluor phalloidin 660 Invitrogen A22285
ImageStreamX Amnis Corporation 100200 Options: 658nm laser, autosampler
Sodium azide Fisher Scientific S 227I-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
  2. Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
  3. Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
  4. Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
  5. Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
  6. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
  7. Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
  8. Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
  9. Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
  10. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
  11. Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
  12. Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
  13. Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
  14. Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
  15. Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., Phillips, G. J., Narasimhan, B., Wannemuehler, M. J., Bellaire, B. H. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884, doi:10.3791/3884 (2012).More

Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., Phillips, G. J., Narasimhan, B., Wannemuehler, M. J., Bellaire, B. H. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884, doi:10.3791/3884 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter