В этой статье мы опишем метод с использованием нескольких спектральных изображений проточной цитометрии для количественного определения интернализации polyanhydride наночастиц или бактерий RAW 264.7 клеток.
Наночастиц системы появились как ценный инструмент в вакцинации благодаря их способности эффективно доставлять грузы, в том числе белков, антиген представляющих клеток 1-5. Интернализация наночастиц (NP) на антиген представляющих клеток является важным шагом в создании эффективного иммунного ответа на антиген инкапсулированные. Чтобы определить, как изменения в функции воздействия наночастиц разработки, мы стремились развивать высокую пропускную способность, количественного экспериментального протокола, совместимое с обнаружением интернализованной наночастиц, а также бактерии. На сегодняшний день два независимых методов микроскопии и проточной цитометрии, были методы, используемые для изучения фагоцитоза наночастиц. Высокая пропускная способность природы проточной цитометрии создает надежные статистические данные. Однако, из-за низкого разрешения, он не точно количественно внутреннюю против клетки связанных наночастиц. Микроскопии генерирует изображения с высоким пространственным разрешением, чowever, это отнимает много времени и включает в себя небольшие размеры образцов 6-8. Multi-спектральных изображений проточной цитометрии (MIFC) является новой технологией, которая включает в себя аспекты как микроскопии и проточной цитометрии, который выполняет многоцветные спектральные флуоресценции и светлого поля изображения одновременно через ламинарный ядра. Эта функция обеспечивает точный анализ интенсивности флуоресцентного сигнала и пространственных отношений между различными структурами и клеточных функций на высокой скорости.
Здесь мы опишем метод с использованием MIFC для характеристики клеточных популяций, которые усвоили polyanhydride наночастиц или Salmonella enterica серовар Typhimurium. Мы также опишем приготовление суспензии наночастиц, мечения клеток, приобретение по системе ImageStream X и анализа данных с использованием идей применения. Мы также продемонстрировать применение метода, который может быть использован для отличать интернализации рathways для наночастиц и бактерий с помощью цитохалазином-D в качестве ингибитора актин-опосредованного фагоцитоза.
Исследования показали, что биоразлагаемые наночастицы на основе поли (молочной-со-гликолевой кислоты (PLGA) или полиангидриды могут быть использованы для доставки антигенов или инкапсулированных препаратов к клеткам-мишеням. Поглощение этих наночастиц фагоцитирующих клеток имеет важ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить ОНР-MURI Award (NN00014-06-1-1176) и армии США медицинских исследований и материального Command (Грант номера W81XWH-09-1-0386 и W81XWH-10-1-0806) за финансовую поддержки.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
24-well plate | TPP | 92024 | |
Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |