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Bioengineering

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

doi: 10.3791/3884 Published: June 8, 2012

Summary

En este artículo se describe un método que utiliza multi-espectral citometría de flujo de imágenes para cuantificar la internalización de nanopartículas polianhídrido o bacterias de las células RAW 264.7.

Abstract

Sistemas de nanopartículas se han convertido en herramientas valiosas en la entrega de vacunas a través de su capacidad de entregar de manera eficiente la carga, incluyendo las proteínas, las células presentadoras de antígeno 1-5. La internalización de las nanopartículas (NP) por las células presentadoras de antígenos es un paso crítico en la generación de una respuesta inmune efectiva contra el antígeno encapsulado. Para determinar cómo los cambios en la función del impacto de las nanopartículas formulación, hemos tratado de desarrollar un alto rendimiento, cuantitativa protocolo experimental que fuera compatible con la detección de nanopartículas internalizados, así como las bacterias. Hasta la fecha, dos técnicas independientes, microscopía y citometría de flujo, han sido los métodos utilizados para estudiar la fagocitosis de las nanopartículas. La naturaleza de alto rendimiento de la citometría de flujo genera datos estadísticos robustos. Sin embargo, debido a baja resolución, se produce un error de cuantificar con precisión internalizado versus celulares nanopartículas consolidados. Microscopía genera imágenes con alta resolución espacial, hin embargo, es mucho tiempo e involucra a pequeños tamaños de muestra 6-8. Multi-espectral de la citometría de flujo de imágenes (MIFC) es una nueva tecnología que incorpora aspectos tanto de la microscopía y citometría de flujo que realiza multicolor de imágenes espectrales de fluorescencia de campo y brillante al mismo tiempo a través de un núcleo laminar. Esta capacidad proporciona un análisis preciso de la intensidad de la señal fluorescente y las relaciones espaciales entre las diferentes estructuras y funciones celulares a alta velocidad.

En este documento, se describe un método que utiliza MIFC para caracterizar las poblaciones celulares que han internalizado las nanopartículas polianhídrido o Salmonella enterica serovar Typhimurium. También describe la preparación de suspensiones de nanopartículas, el etiquetado de células, la adquisición de un sistema de IMAGESTREAM X y análisis de los datos mediante la aplicación de IDEAS. También demuestran la aplicación de una técnica que puede utilizarse para diferenciar la internalización pathways de las nanopartículas y las bacterias mediante el uso de citocalasina-D como un inhibidor de la fagocitosis mediada por actina.

Protocol

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1. RAW 264.7 de Cultivos Celulares

  1. Cosecha de células RAW 264.7 de sus frascos cuando llegan a la confluencia raspando suavemente con un raspador de células. Recuento y la placa de ellos en una placa celular de 24 pocillos de cultivo a una densidad de 5 x 10 5 células / pocillo en 0,5 ml completa Medio de Dulbecco Modificado de Eagle (cDMEM; 10% inactivado por calor suero bovino fetal (FBS), 2 mM de Glutamax, y HEPES 10 mM) e incubar durante una noche a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora.

2. Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028 Transformación y Cultura

  1. Introducir plásmidos recombinantes que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) a S. Typhimurium por electroporación. En primer lugar, preparar a la cultura de Salmonella enterica serovar typhimurium (ATCC 14028) en caldo LB y se incuba durante la noche a 37 ° C con aireación.
  2. Al día siguiente, gránulo 1 ml de las bacterias a la velocidad máxima en una microcentrífuga. Se lavan las células foveces ur con 1 ml de MOPS fríos o solución de glicerol (1 mM de 3 - (N-morfolino) propanosulfónico (MOPS) en tampón de glicerol al 20%) por suavemente resuspender el sedimento con una pipeta entre cada lavado 9. Después del lavado final, resuspender el precipitado en 50 l de MOPS / glicerol en el que ~~~V~~HEAD=NNS 0,5 g de pAKgfp1 o pAKgfplux1 ADN plásmido se ha añadido 10.
  3. Transferir la suspensión celular a un pre-enfriado cubeta de 1 mm de electroporación brecha y electroporar con la configuración: 1800 V, 200 W, 25 MF. Inmediatamente después del parto el pulso, agregar 1 ml de caldo LB y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml nueva. Permitir que las células se recuperan a 37 ° C con aireación. Después de una hora, concentrar las células por centrifugación y se resuspende en 100 ~ l de sobrenadante restante.
  4. Finalmente, la placa de las células sobre placas de LB que contenían 100 mg / ml de ampicilina y se incuba durante una noche a 37 ° C. Las colonias individuales se purifican por restreaking con la selección de los antibióticos y la expresión de las buenas prácticas agrarias is confirmó por la iluminación con un isotiocianato de fluoresceína estándar (FITC), conjunto de filtros.
  5. Se inoculan 10 ml de caldo LB que contenía 25 mg / ml de ampicilina (o antibiótico apropiado) con un asa de siembra de Salmonella que se ha transformado a establemente GFP expresa.
  6. Crecer las bacterias durante la noche a 37 ° C.
  7. Diluir 1:10 Salmonella en un tubo de cultivo fresco que contiene 10 ml de LB suplementado con ampicilina y se incuba durante 5 horas a 37 ° C.
  8. Medir la absorbancia del cultivo a 600 nm y calcular la concentración de la Salmonella por ml utilizando una curva de crecimiento previamente establecer.
  9. Diluir la Salmonella en cDMEM (0,5 ml / pocillo) para obtener una multiplicidad de infección (MOI) de 100 por RAW 264,7 celular.

3. Preparación de la suspensión de nanopartículas

  1. Fabricar 1% de FITC-nanopartículas cargadas como se describe anteriormente 11. Brevemente, las partículas son fabricadas por polianhídridoanti-disolvente nanoencapsulación, en el que se disuelve el polímero en cloruro de metileno (4 ° C a una concentración de 25 mg / ml) y se precipitó en pentano (-30 ° C en un cloruro de metileno relación 1:200: pentano). Recuperar las nanopartículas por filtración al vacío. Después de evaporar cualquier solvente residual, pese la polianhidrido seca esterilizada mediante nanopartículas de peso de papel.
  2. Añadir 5 mg de nanopartículas a 0,5 ml de frío tampón fosfato salino (PBS, calcio y magnesio libre, pH 7,4) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y mantener en hielo hasta que las nanopartículas se añaden a las células RAW 264.7.
  3. Soníquelos la suspensión de nanopartículas (mientras se mantiene en hielo) usando un procesador de ultrasonidos líquido equipado con una micropunta de aproximadamente 25 s de 4 a 6 julios.

4. Ensayo de fagocitosis

  1. Trate previamente un subconjunto de las células RAW 264.7 con 5 mg / ml de citocalasina-D 1 hora antes de la introducción de NP o Salmonella por aspiración de mediano y REPLacing con cDMEM fresco suplementado con el inhibidor. Volver a los cultivos a 37 ° C incubadora.
  2. Después de la 1 h de incubación con el inhibidor, retirar las placas de la incubadora, vórtice de la suspensión de nanopartículas, y se añaden 10 l en los pocillos correspondientes.
  3. Vortex la Salmonella y infectar las células RAW 264.7 con una MOI de 100 mediante la adición de las bacterias a los pocillos apropiados.
  4. Toque en los tiempos de la placa pocos para mezclar y se incuba a 37 ° C o 4 ° C (control) durante 45 min.
  5. Retire las placas de la incubadora o en el refrigerador y el lugar en el hielo. Se lavan las células dos veces con PBS enfriado con hielo (sin Ca 2 + y Mg 2 +) por aspiración y desechar el medio viejo para eliminar partículas sueltas, Salmonella y las células muertas o individual RAW 264.7.
  6. Para cosechar las células RAW 264.7 después del segundo lavado, añadir 250 l de helado de PBS y raspe suavemente los pozos.
  7. Pipetear las células recolectadas en el complemento micro clara visión del límitetubos de centrífuga y mantener en hielo.
  8. Se lavan las células mediante la adición de 1 ml de tampón de lavado en frío (2% de FBS inactivado por calor, 0,1% de azida sódica en PBS) y se centrifuga a 250 x g durante 10 min a 4 ° C.
  9. Eliminar el sobrenadante y eliminar el tampón residual tocando el tubo de microcentrífuga invertida sobre una toalla de papel. Resuspender el botón celular suavemente rastrillar el tubo de microcentrífuga a través de una rejilla de tubo de ensayo.
  10. Fijar los células RAW 264.7 mediante la adición de 100 l de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS y permitir que las células en reposo durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
  11. Lavar las células RAW 264.7 mediante la adición de 1 ml de tampón de Perm / Wash (BD Biosciences) y se centrifuga a 250 x g durante 10 min a 4 ° C.
  12. Repita el paso 4.9.
  13. Teñir las células RAW 264.7 de actina mediante la adición de 100 l de tampón de Perm / Wash contiene Alexa Fluor faloidina 660 (AF 660, 1:150 dilución) durante 15 min a temperatura ambiente. Repita los pasos 4.11 y 4.12.
  14. Resuspender las células RAW 264.7 en 50 l dePBS con 1% de PFA y almacenarlos en la oscuridad a 4 ° C hasta el momento de adquisición.

Consejos y notas:

  • Muestras individuales de fluorescencia de color deben estar preparados en este paso que se utilizaron como controles de compensación, mientras que la creación del instrumento de IMAGESTREAM X. La compensación de los controles incluidos en este experimento fueron: las células RAW 264.7 (que no estén etiquetados para la actina) se incubaron con las nanopartículas, las células RAW 264.7 (que no estén etiquetados para la actina) se incubaron con Salmonella; actina etiquetados sólo las células RAW 264.7.
  • Para los estudios de inhibidor, es importante incluir el control del vehículo en el cual se disolvió el inhibidor como un control. En este experimento, citocalasina-D se disolvió en 100% de DMSO. Nosotros, por tanto, las células incubadas en cDMEM que contiene DMSO y luego se evaluó la internalización de nanopartículas o Salmonella. No se detectó ninguna diferencia significativa entre el grupo medio de control y DMSO (datos no presentados).
  • La SAguía de preparación MPLE disponible en el sitio web de Amnis ( https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf ) es un buen recurso para comprobar la compatibilidad de fluoróforos con la X IMAGESTREAM. Para acceder a este documento, los usuarios deben registrarse primero (libre de cargo) con Amis.

5. Ejemplo de Adquisición en el X IMAGESTREAM

  1. Encienda IMAGESTREAM X y el lanzamiento de INSPIRE.
  2. Inicializar fluidos. Al final de esta secuencia de comandos SpeedBeads debe estar en ejecución.
  3. En el menú Archivo, seleccione Cargar plantilla predeterminada.
  4. En el menú Ver galería de imágenes, seleccione TODO y pulse Ejecutar para iniciar el programa de instalación de imágenes de las cuentas.
  5. Ajuste básico de seguimiento a las imágenes del centro lateral (si es necesario).
  6. Seleccione el campo claro (BF) de canales y haga clic en la intensidad ajustada.
  7. Espere hasta que el CV de velocidad de flujo es constante-le-SS de 0,2%.
  8. Calibrar el instrumento todos los días. En la ficha ASSIST, haga clic en Iniciar para ejecutar todas las calibraciones y pruebas y comprobar que todos ellos han pasado.
  9. Presione Lock Flush y de carga (FLL) para cargar la primera muestra. Cargue el más brillante de la muestra en el experimento que presenta fluorescencia con cada fluorocromo utilizado. Es muy importante que se ejecuta esta primera muestra para establecer los parámetros del instrumento y luego no las cambia para todo el experimento.
  10. Encienda cada láser que se utiliza en el experimento y establecer la potencia del láser para que cada fluorocromo tiene valores máximos de píxeles entre 100 y 4000 puntos, medidos en los gráficos de dispersión.
  11. Establecer los criterios de clasificación de células, para eliminar la colección de objetos no deseados. Para la recogida de datos sólo de las celdas, seleccione Límite de la Zona Baja en el canal de BF a 50 micras. Los objetos con superficie inferior a 50 micras, se tendrán en cuenta los desechos y no serán adquiridas. Seleccione los canales que deben recogerse.
  12. Introduzca el nombre de archivo, carpeta de destino, secuencia que se# A 1 y el número de eventos para adquirir.
  13. Haga clic en Ejecutar Adquirir para recoger y guardar el primer experimento archivo de datos.
  14. Haga clic en FLL y ejecutar el ejemplo experimental siguiente. Repita hasta que todas las muestras experimentales se han recogido.
  15. Haga clic en Configuración Comp (se apaga claro y láser de dispersión y permite la recogida de todos los canales) y cobrar 500 células positivas de cada muestra teñida única para cada fluoróforo en el experimento para desarrollar una matriz de compensación.

En resumen, las muestras se pueden ejecutar en el siguiente orden:

  • Brillante primera muestra.
  • El resto de muestras de ensayo.
  • Compensación de los controles que contiene la fluorescencia de un solo color.

Consejos y notas:

  • Una plantilla de INSPIRE se pueden guardar y volver a cargar para configurar los ajustes del instrumento. Una vez que se guardan las plantillas, el muestreador automático puede ser utilizado para un funcionamiento autónomo para ejecutar los ejemplos experimentales con una plantilla y de la cooperaciónmpensation controla con una plantilla para cada control de un solo color.
  • El IMAGESTREAM X de configuración para estos experimentos: 488 y 658 nm de excitación láser, láser de 785 nm de dispersión; 40X (0,75 NA) objetivo, sistema de 6 canales con un nivel de pila ISX filtro. La opción inyector automático se utiliza para permitir la adquisición desatendida de las muestras.
  • Los siguientes valores se utilizaron para el experimento. Las nanopartículas fueron fotografiadas con el láser de 488 nm establece en 10 MW, el láser de 658 nm, ajustado a 50 mW, el láser de 785 nm establece en 2 mW y BF en el canal 1. Las células de Salmonella se obtuvieron imágenes de infectados con el láser de 488 nm ajustado a 20 mW, 658 nm láser ajustado a 50 mW, el láser de 785 nm establece en 2 mW, y BF en el canal 1. Controles de compensación se recogieron en la ausencia de BF y 785. Por lo menos 5000 eventos (es decir, las células) fueron imágenes para cada una de las muestras de ensayo.

6. Análisis de Imagen

  1. Lanzar ideas y haga doble clic en el asistente de internalización y la carga ene de la muestra. archivos rif.
  2. Crear una matriz de compensación haciendo clic en "Nueva Matriz" en el paso 2. El asistente de la indemnización se puso en marcha. Añadir archivos para los controles de un solo color en el experimento. Haga clic en Siguiente en el asistente siguiendo las instrucciones hasta que el archivo matriz de compensación se guarda y se carga en la caja en el paso 2 del asistente de la internalización.
  3. Haga clic en Siguiente y siga las instrucciones hasta que un archivo. Daf se genera.
  4. Establecer las propiedades de visualización de imágenes mediante la selección de los canales de imagen utilizados durante la adquisición. Haga clic en el Canal 2 (FITC) y el capítulo 5 (AF 660). (BF y cooperación Sur-Sur son seleccionado por defecto).
  5. Seleccione el canal de la imagen para hacer que el límite de celda (CH01) y el canal en el que las nanopartículas o bacterias se recogieron (CH02).
  6. Un gráfico de dispersión de Brightfield área frente a la relación de aspecto Brightfield de todas las células se genera. Definir la población de células única haciendo clic en los puntos individuales y de compuerta cerca de maillots. Las células individuales tienen una relación de aspecto de una1 ª ronda y dobletes alrededor de 0,5 (Figura 1A).
  7. Un histograma de la raíz del gradiente de campo claro Mean Square (RMS) de la imagen de campo claro se genera y la opinión de la población en la galería de imágenes se ajusta a bin seleccionado (fig. 1B). Haga clic en los contenedores para determinar que las células en mejor enfoque comenzar y establecer una zona de la puerta se centraron en las células. Cuanto mayor es el gradiente de RMS, mejor enfocado. Salte el paso siguiente a menos que haya otro tipo de manchas que desee a la puerta de adelante.
  8. Un gráfico de dispersión de la nueva intensidad del Canal 2 en el eje x Pixel contra Max de CH2 en el eje y se genera (fig. 1C). Haga clic en los puntos y ver las imágenes que le ayudarán a dibujar la región en torno a las células que son positivas para las nanopartículas o bacterias.
  9. Un histograma de la característica de internalización se genera con una región que comienza en 0, lo que debería ser ajustado mediante la observación de imágenes (Figura 1D). La característica de internalización es una relación entre elintensidad dentro de la célula a la intensidad de la célula entera. Se escala tal que en un valor de 0 aproximadamente la mitad de la intensidad que hay dentro. El asistente ha creado una región para designar el interior haciendo una máscara que ha utilizado la imagen de entrada de células a partir del paso 5 para encontrar la superficie celular y erosionado esta por 4 píxeles. Nótese que esta máscara se puede ajustar manualmente para diferentes tipos de células cuando sea necesario. En este experimento, se ajusta manualmente la característica mediante la creación de una máscara de objetos en la imagen campo claro primero y erosionado por este 4 pixeles. La función de internalización se calculó sobre la base de esta máscara Objeto 4 píxeles erosionada. Esta característica nos permite distinguir las partículas internalizadas y las bacterias, que tienen la mayor parte de su señal de fluorescencia dentro de los límites de máscaras, de partículas de la superficie determinada y bacterias, que tienen la mayor parte de su señal de fluorescencia fuera del límite de la máscara (Figura 2).
  10. Crear un nuevo histograma con la incorporación de nueva FEAtura sobre la base de la máscara del objeto erosionado. Dibuja una región a la puerta en las células internalizadas por ver las imágenes en el modo de bin seleccionado. En nuestros experimentos, hemos creado este portal en el 0,3. Las células con una puntuación inferior a 0,3 se consideran células de la superficie determinada de partículas positivas.
  11. Por último, para eliminar las células con el etiquetado de fondo e identificar las nanopartículas internalizadas o bacterias, el Punto de IDEAS función Contar fue utilizado. Recuento de manchas es una función que cuenta el número de componentes conectados o máscaras pequeñas de una imagen. Las funciones de la máscara, al contado, el pico y la intensidad se utiliza para definir los puntos. La máscara lugar encuentra los detalles brillantes en una imagen que tiene un radio especificado por el usuario y el umbral por encima del fondo local, la máscara se refina mediante la descomposición de altas intensidades en los puntos individuales utilizando la función de pico y, a continuación puntos por encima de una intensidad de 200 recuentos se incluyeron . Consulte la guía del punto de enmascaramiento Amnis para más información (Figura 1E). A las estadísticas re la plantilla del puerto se ha generado mediante la inclusión de varias características en el menú Informes.
  12. Este archivo se guarda como archivo de plantilla que se utilizará para el análisis de todos los archivos de proceso por lotes experimentales.
  13. En el software de IDEAS, haga clic en Herramientas → datos de lotes de archivos de entrada y todos los archivos. Rif. Agregue el archivo matriz de compensación (. CTM) y el archivo de plantilla (. Ast) en las secciones correspondientes. Presentar el lote para su procesamiento. Después de la etapa de procesamiento, todos los archivos. Rif son analizados y los archivos. Daf se generan para cada uno de los archivos primas individuales. Un archivo de informe final se genera con las estadísticas de todas las muestras.

Consejos y notas:

  • Análisis de imágenes se realizó con el programa IDEAS versión 4.0 y el asistente de internalización con algunas modificaciones. El asistente es la auto-instructiva y la ouptput. Archivo de DAF se pueden generar, siguiendo las instrucciones del asistente.

7. Los resultados representativos

"> Las imágenes representativas de la Figura 2 demuestran que MIFC puede ser utilizado para distinguir correctamente entre internalizada (panel izquierdo) frente a la superficie de la envolvente (panel derecho) NP (Figura 2A) o Salmonella (Figura 2B). Internalización de NP y Salmonella se redujeron en un tanto actina inhibir y reducir la temperatura a 4 ° C (Fig. 3A). El porcentaje de células positivas para la superficie obligado NP aumentó de aproximadamente 8% a 37 ° C a más de 35% después de que cualquiera citocalasina-D o 4 ° C tratamiento ( Fig. 3B). En contraste, el porcentaje de células con Salmonella superficie envolvente se redujo de 35% a 15% después de citocalasina-D tratamiento. La incubación de células RAW 264.7 con Salmonella a 4 ° C disminuyó internalización sin un aumento aparente en la cantidad de superficie obligado bacterias en comparación con el 37 ° C de control. En conjunto, estos datos demuestran que <em> Salmonella y NP son internalizados por un proceso similar celular que requiere la actina y es dependiente de la temperatura. Por otra parte, los datos indican que el apego sostenido de la Salmonella a los macrófagos requiere polimerización de la actina.

Figura 1
Figura 1. Esquema de la estrategia de puerta utilizado para determinar la superficie de las nanopartículas internalizado contra consolidados y Salmonella. (A) Para limitar el análisis a las células individuales, es importante para eliminar los desechos y los eventos multi-celulares. Las células individuales y dobletes fueron separados de agregados multicelulares que utilizan la zona IDEAS características y relación de aspecto de la imagen de campo claro (M01). El área es el tamaño de la imagen en micras cuadradas y la relación de aspecto es el eje menor, dividido por el eje mayor y por lo tanto una medida de la circularidad (un círculo perfecto tendrá una relación de aspecto de 1; dobletes tienen típicamente aspeproporciones de alrededor de 0,5 quilates y agregados multicelulares son típicamente menos de 0,5). Una región se señaló a la puerta en los eventos de una sola célula (Paso 6.6). (B) a la puerta en las células que tiene el foco, las ideas de características degradado RMS de la imagen de campo claro se representa en un histograma. La característica de gradiente de RMS mide la calidad nitidez de una imagen mediante la detección de cambios de los valores de pixel en la imagen. Un gradiente de mayor valor RMS indica una imagen más centrada (Paso 6.7). (C) Green células positivas de fluorescencia fueron seleccionados por inyección en las células con altos valores de píxel Max e intensidad en el canal verde fluorescente (Paso 6.8). (D) Células con NP internalizada o Salmonella fueron seleccionados por la elección de la población de células con una puntuación de internalización igual o mayor que 0,3. Las células que reciben una puntuación inferior a 0,3 se considera que la superficie obligado (Paso 6,9). (E) Las células en el "internalizada" puerta se caracteriza además basado en el número de manchas (NP o STM) porque existene fueron algunas células con tinción de fondo que se cuentan como internalizada, pero tenía un valor contado de cero (Paso 6.11). Las imágenes representativas se presentan para cada puerta. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2. Imágenes de células de nanopartículas unidas internalizados y la superficie (NP), o Salmonella. (A) imágenes representativas de las células RAW 264.7 que internalizada NP (panel izquierdo) y las células a las que NP estaban obligados a su superficie, pero no interiorizada (panel derecho). (B) imágenes representativas de las células RAW 264.7 que la Salmonella internalizada (panel izquierdo) y las células de Salmonella a los que estaban vinculados a su superficie, pero no interiorizada (panel derecho).

Figura 3
Figura 3. Cytochalatratamiento de pecado-D inhibe la internalización de las células de NP y Salmonella. (A) El tratamiento previo de las células RAW 264.7 con citocalasina-D o la incubación a 4 ° C reduce la incidencia de la internalización NP o Salmonella, en comparación con las células RAW 264.7 se incubaron a 37 ° C en medio. RAW 264.7 células incubadas en medio que contiene DMSO (es decir, de control del vehículo) mostraron niveles similares de internalización para NP y Salmonella en comparación con medio solo (datos no presentados). (B) El pretratamiento de células RAW 264.7 con citocalasina-D aumentó el porcentaje de células con la superficie obligado NP mientras que disminuye el porcentaje de células con Salmonella superficie envolvente.

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Discussion

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Los estudios han demostrado que las nanopartículas biodegradables a base de poli (láctico-co-ácido glicólico (PLGA) o polianhídridos pueden ser utilizados para entregar antígenos encapsulados o fármacos a células diana. Captación de estas nanopartículas por las células fagocíticas es importante para su eficacia, haciendo así cuantitativo . análisis de la internalización crítico en el diseño de nuevos sistemas de entrega de nanopartículas Mediante este método, la absorción diferencial de nanopartículas de diversos tipos de células pueden ser analizados con facilidad Hasta la fecha, la microscopía convencional y citometría de flujo han sido utilizados para la cuantificación de la captación de partículas;. sin embargo, su respectivo limitaciones con un alto rendimiento y resolución requieren enfoques alternativos para el estudio de la internalización. En este artículo, el análisis MIFC para caracterizar y comparar cómo el proceso biológico de la fagocitosis se diferencia entre dos tipos de objetivos-a las nanopartículas de patógenos bacterianos y sintéticos.

El phagocytos MIFCSe ensayo se utilizó para delinear las diferencias en el mecanismo que subyace a la captación de Salmonella en comparación con las nanopartículas. Cabe señalar que los inhibidores pueden ser citotóxicos en función de su tiempo de incubación y la concentración, por lo que un perfilado citotoxicidad previa (es decir, el tiempo de exposición y la concentración) es necesaria antes de su uso 13,14. Dependiendo de su formulación química, las nanopartículas pueden tener una temperatura de transición vítrea (Tg = 13 ° C) por debajo de RT, en consecuencia, forman agregados a TA 15. Para superar la agregación, se sonicó las partículas y los mantuvo en hielo antes de la adición a los cultivos celulares. Los estudios cinéticos de la absorción de nanopartículas proporcionan información importante sobre la eficiencia de estas partículas para proporcionar la carga útil encapsulada a las células presentadoras de antígenos. Se debe tener cuidado para mantener las células en hielo al final de un punto de tiempo dado para inhibir aún más los procesos celulares. Para este fin, hemos observado variabilidad en cellular absorción cuando las células no se colocaron en hielo. Una limitación del método descrito anteriormente es que el experimento se lleva a cabo en células adherentes que requieren técnicas de raspado para cosechar las células fagocíticas. Este procedimiento podría resultar en la muerte celular, introduciendo así un error en el análisis de datos. El procedimiento se describe en este documento también podría llevarse a cabo utilizando células que crecen en suspensión.

La incubación de los macrófagos con colorantes reactivos o reactivos inmunomarcación fue optimizado mediante la reducción de la cantidad de tampón residual presente fijación. La presencia de tampón residual crea un efecto de dilución y puede producir la muestra a la variación de la muestra entre las múltiples muestras, lo que resulta en inconsistentes valores medios de intensidad de fluorescencia. Concentración de la muestra (es decir, las células / mL) es también un factor importante a considerar durante la etapa de adquisición, como resultado de las muestras diluidas en los tiempos de funcionamiento. Para una comparación multi-paramétrico entre diferentesLas muestras experimentales, es importante para mantener la intensidad del láser constante.

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Disclosures

Sherree amigo L. se emplea por Amnis Corporation, que fabrica el sistema X IMAGESTREAM.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer el Premio ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) y el Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material de comandos (números de concesión W81XWH-09-1-0386 y W81XWH-10-1-0806) de financiera apoyar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RAW 264.7 cell line American Type Culture Collection (ATCC) TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Cellgro 10-013-CV
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S 11150 Premium Grade
Glutamax GIBCO, by Life Technologies 35050-061
HEPES GIBCO, by Life Technologies 15630-080
24-well plate Techno Plastic Products 92024
Cell culture Flasks Techno Plastic Products 90151
Cell scraper Techno Plastic Products 99002 24 cm
Salmonella entericaserovar Typhimurium ATCC 14028
BTX ECM630 Electro Cell Manipulator BTX Technologies
MOPS Fisher Scientific BP308
Phosphate buffered saline (PBS) Cellgro 21-040-CV
Ultrasonic liquid processor Misonix S-4000
Cytochalasin-D Sigma-Aldrich, C8273
Formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Wash buffer 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS.
Perm/wash buffer BD Biosciences 554714
Clear-view snap cap microtubes Sigma-Aldrich T4816
Alexa Fluor phalloidin 660 Invitrogen A22285
ImageStreamX Amnis Corporation 100200 Options: 658nm laser, autosampler
Sodium azide Fisher Scientific S 227I-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes
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Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., Phillips, G. J., Narasimhan, B., Wannemuehler, M. J., Bellaire, B. H. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884, doi:10.3791/3884 (2012).More

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