Analysera Cellulär internalisering av Nanopartiklar och bakterier genom att multispektralt Imaging Flow Cytometry
Summary
I den här artikeln beskriver vi en metod som utnyttjar multispektralt metri avbildning flöde till kvantifiera internalisering av polyanhydrid nanopartiklar eller bakterier från RAW 264.7 celler.
Abstract
Nanopartikulära system har visat sig vara värdefulla verktyg i vaccinet levereras genom sin förmåga att effektivt leverera gods, inklusive proteiner, till antigenpresenterande celler 1-5. Internalisering av nanopartiklar (NP) av antigenpresenterande celler är ett kritiskt steg vid generering av en effektiv immunrespons till det inkapslade antigenet. För att bestämma hur förändringar i nanopartikelformulering påverkan funktion, försökte vi utveckla en hög genomströmning, kvantitativ experimentell protokoll som var förenligt med att upptäcka internaliserade nanopartiklar samt bakterier. Hittills har två oberoende tekniker, mikroskopi och flödescytometri, varit de metoder som används för att studera fagocytos av nanopartiklar. Den höga genomströmningen natur flödescytometri genererar tillförlitliga statistiska uppgifter. På grund av låg upplösning, inte att exakt kvantifiera internaliserat kontra cellbundna nanopartiklar. Mikroskopi genererar bilder med hög rumslig upplösning, however, det är tidskrävande och innebär små urvalsstorlekar 6-8. Multispektralt imaging flödescytometri (MIFC) är en ny teknik som inbegriper aspekter av både mikroskopi och flödescytometri som utför flera färger spektral fluorescens och ljusa fältet avbildning samtidigt genom ett laminärt kärna. Denna funktion ger en korrekt analys av fluorescerande signal intensiteter och rumsliga relationer mellan olika strukturer och cellulära funktioner vid hög hastighet.
Häri beskriver vi en metod som utnyttjar MIFC att karakterisera cellpopulationer som internaliserade polyanhydrid nanopartiklar eller Salmonella enterica serovar Typhimurium. Vi beskriver också beredningen av nanopartiklar suspensioner, cell märkning, förvärv på en ImageStream X-system och analys av data med hjälp av IDÉER ansökan. Vi visar också att tillämpningen av en teknik som kan användas för att differentiera internalisering pathways för nanopartiklar och bakterier genom användning av cytokalasin-D som en inhibitor av aktin-medierad fagocytos.
Protocol
Discussion
Studier har visat att bionedbrytbara nanopartiklarna baserade på poly (mjölksyra-sam-glykolsyra (PLGA) eller polyanhydrider kan användas för att leverera antigener inkapslade eller läkemedel till målceller. Upptag av dessa nanopartiklar av fagocytiska celler är viktig för deras effektivitet, vilket gör kvantitativ . analys av internalisering kritisk vid utformning av nya system nanopartiklar leveranssystem Genom att använda denna metod kan differentiell upptag av nanopartiklar av olika celltyper skall analyser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka ONR-Muri Award (NN00014-06-1-1176) och den amerikanska armén medicinsk forskning och Materielverk (Grant Numbers W81XWH-09-1-0386 och W81XWH-10-1-0806) för den finansiella stöd.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
References
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
- Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
- Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
- Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
- Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
- Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
- Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
