Summary
Isotachophoresis (ITP) היא הפרדה electrokinetic חזקים בטכניקה preconcentration עם יישומים החל איתור הרעלן הכנת המדגם. אנו בודקים את עקרונות פיסיקליים של ITP ו המתודולוגיה של יישום טכניקה זו שני יישומים דוגמה ספציפית: הפרדה וזיהוי של מולקולות קטנות וטיהור של חומצות גרעין מ lysate תרבית תאים.
Abstract
טכניקות Electrokinetic הם מרכיב עיקרי של יישומים microscale בגלל היכולת הייחודית לבצע מגוון של תהליכים fluidic ו electrophoretic ב, מערכות קומפקטיות פשוטות ללא חלקים נעים. Isotachophoresis (ITP) היא טכניקה electrokinetic פשוט מאוד חזקים שיכולים להשיג הפרדה של פי 1,2 מיליון preconcentration ויעיל והפקת המבוסס על ניידות יוניים. 3 לדוגמה, אנו הוכיחו את היישום של ITP להפרדה וזיהוי רגיש ללא תווית מולקולות יוניים (רעלים כגון DNA, rRNA, מירנה) עם מעט או ללא הכנה מדגם 4-8 ו מיצוי וטיהור של חומצות גרעין של מטריצות מורכבות כולל תרבית תאים, שתן ודם. 9-12
ITP משיגה מיקוד ההפרדה באמצעות שדה חשמלי היישומי שני מאגרים במערכת ערוץ fluidic. עבור analytes anionic, מובילה את האלקטרוליט (LE) חיץ נבחר שלuch כי אניונים שלה יש יותר ניידות electrophoretic יעיל יותר אניונים של אלקטרוליט נגרר (TE) חוצץ (ניידות אפקטיבית מתאר את מהירות סחיפה הנצפה של יון ולוקח בחשבון את המדינה יינון של יון, כפי שתואר על ידי Persat ואח' בפירוט . 13). לאחר כינון הממשק בין TE ולה, שדה חשמלי מוחל כך יונים לה טמפ להתרחק מהאזור הכבוש על ידי יוני te. יונים לדוגמה גזע ביניים ניידות יעילה לקראת יוני טה אבל אני לא מצליח לעקוף יונים לה טמפ, ולכן הם מתמקדים בממשק LE-TE (להלן "ממשק ITP"). יתר על כן, TE ואזורים לה טמפ טופס של מוליכות נמוכה בהתאמה גבוהה, אשר להקים שיפוע תלול שדה חשמלי על הממשק ITP. זה שיפוע בתחום preconcentrates מינים המדגם כפי שהן להתמקד. בחירה נכונה של תוצאות טה LE להתמקד וטיהור של מינים שאינם יעד ממוקד מינים אחרים, ובסופו של דבר ההפרדההפרדה ד מינים לדוגמה.
אנחנו כאן לסקור ITP עקרונות פיסיקליים בבסיס ולדון בשני מצבים סטנדרטיים של המבצע: "השיא" מצבי "מישור". במצב שיא, יחסית לדלל יונים מדגם להתמקד יחד בתוך חופפים פסגות צרים על הממשק ITP. במצב הרמה, יונים מדגם שופע יותר להגיע לריכוז המצב היציב ואת לבודד את הרמה, כמו אזורים סמוכים שהוזמנו על ידי ניידות יעילה שלהם. מצבי שיא הרמה נובעים מתוך פיזיקה בסיסית אחת, אלא לייצג משטרים שונים הנבדלות ריכוז אנליטי הראשונית ו / או את משך הזמן המוקצב הצטברות המדגם.
אנחנו הראשונים לתאר בפירוט השיא מודל הניסוי מצב ואז להראות assay מצב שיא החילוץ של חומצות גרעין מ - א ' תא קולי התרבות. אנו מסיקים על ידי הצגת מצב assay הרמה, שבה אנו משתמשים שאינם מתמקדים נותבים (NFT אזור) מינים לדמיין את ההפרדה ליוצרים quantitation של חומצות אמינו.
Protocol
1. פיסיקה של ITP
ITP מהווה גבול המרגש חריף בין יונים של תשלום כזה. הטכניקה ניתן לבצע באמצעות דגימות anionic או קטיוני, אך אנו מתאימים את ההקדמה הזו כדי ITP anionic ורשום אותם העקרונות חלים על ITP קטיוני. אנחנו בוחרים לה טמפ ו TE מאגרים כאלה יונים יש לה טמפ גבוהה ניידות אפקטיבית גודל electrophoretic. Μ יעיל electrophoretic, ניידות = U / E, הוא המידתיות מתמיד בין השדה החשמלי יישומית, E, ומהירות סחיפה יון, U. 13 יש להקים ממשק מפוזר בין LE ו TE וליישם שדה חשמלי מכוון מ גבוהה מוליכות LE האזור נמוך מוליכות TE אזור. המערכת במהירות קובע שיפוע חזק שדה חשמלי על הממשק ITP, בשל פרופיל לא אחידה מוליכות. לפי השם שלו (מיוונית, "ISOs" פירושו "שווה", "takhos" פירושו "מהירות"), TE ולנסוע LE יונים בבית יש, גם במדיםlocity, כתוצאה של שדה לא אחידה חשמל ושימור הנוכחי (זה מה שנקרא "מצב ITP", ראה איור 1).
ממשק ITP היא מובנת חידוד: יוני לה טמפ על ידי דיפוזיה אל תוך החוויה TE אזור השטף שחזור חזק ולחזור לאזור מובילה (ולהפך עבור יונים טה ב אזור LE). יונים לדוגמה להתמקד בממשק זה אם ניידות יעילה שלהם באזור TE עולה על אלה של טה שיתוף יונים, ואם ניידות יעילה שלהם באזור LE הוא פחות מזה של שותף לה טמפ יונים (ראה איור 1). עצמית חידוד ומיקוד המאפיינים של ITP לתרום לחוסנו של טכניקה זו ולהפוך ITP רגיש יחסית הפרעות של ממשק (למשל עקב זרימת הלחץ מונע או שינויים גיאומטריים, כגון התכווצויות, הרחבות, והופכת).
בשנת השיא במצב ITP (ראה איור 2 א 'ו סרטונים 1-2), יון ריכוזים לדוגמה הםבכל עת נמוך משמעותית LE ו - טה ריכוזי יונים ולכן תורמים negligibly מוליכות המקומית. ההפצה של יונים מדגם נקבעת על ידי ממשק עצמית חידוד בין אזורים סמוכים (כאן TE ולה) ואת הערך של ניידות מדגם יעיל יחסית לאזורים אלו. 14 יונים מדגם מרובים להתמקד בתוך האזור אותו ממשק צר כמו ITP בעיקר פסגות חופפים. את הממשק שיא רוחב, כמו גם הגורם preconcentration הקשורים, בקנה מידה ביחס הפוך הנוכחית להחיל (ראה ניסויים איור 2b). 14
גבוהה מספיק ריכוז המדגם הראשוני וזמן הצטברות מספקת, יונים מדגם להגיע לערך ריכוז סף. עבור מלוא מיוננים מינים, ערך זה נקבע על ידי פונקציית ויסות Kohlrausch (KRF). 15 עבור אלקטרוליטים חלשים, זה נקבע על ידי הפונקציות Alberty ו Jovin. 16,17 במישורמצב, כמתואר באיור 3 ווידאו 3, יוני מדגם להפריד ולטהר את אזורי ריכוז אחיד מקומי וקבוע בסדר שנקבע על ידי ניידות יעילה שלהם. יונים לדלל מאוד, עדיין עשויים להתמקד במצב שיא בין אזורי רמה. ב ITP, יונים לדוגמה ניתן הציג הזרקת סופית בין TE ולה (ראה איור 3) או מעורב לסירוגין יחד עם TE ו / או LE (ראה איור 2). אנו מתייחסים ערבוב באזור TE כזריקה "חצי אינסופי", אשר ניתן להשתמש בהם כדי לצבור יונים אנליטי רציף. הצטברות מדגם רציף מגדילה רגישות שיא וגם מצב מבחני רמה. עם זאת, זריקות סופיים שכיחים יותר במצב הרמה. סביר להניח כי ריכוזים גבוהים אנליטי הראשוניים הזרקת למחצה אינסופית להגדיל באופן משמעותי את המוליכות TE ושיעורי התמקדות נמוכות יותר. כמו כן, טיהור מלא אינו אפשרי הזרקת חצי אינסופי (שכן יש הרמ"אתוספות ריכוז סופי ב TE).
2. מכשיר ניקוי והכנה
עבור מבחני שהוצגו בפרוטוקול זה אנו משתמשים isotropically רטוב חרוט (חתך בערך D בצורת) שבבי זכוכית microfluidic עם עיצוב בין ערוצים (ראה איור 1). ניקוי הבאים פרוטוקול הכנה מותאמת במיוחד עבור ערוצי סיליקה בורוסיליקט התמזגו, אבל יכול לשמש גם עם זכוכית / PDMS שבבי. לבצע הליך ניקוי לקראת ניסויים כדי להבטיח לרוץ אל להפעיל הדירות ואת יישום מוצלח של ציפויים דינמיים הדרושים כדי לדכא את זרימת electroosmotic (EOF). מחדל של פרוטוקול זה עלול לגרום לפיזור חזק של ממשק ITP. 14
- כדי לטהר את הערוץ, למלא את צפון, מזרח, ודרום מאגרי עם μL 10-20 של אקונומיקה 10% ולהחיל ואקום על מאגר המערבית דקות 2. אם אתה משתמש רגיל Caliper שבב נושא כלים, אבק יכול להיות מיושם בצורה יעילה על ידי פשוט attachinגרם בסופו רחב של μL 200 (בלי פילטר) עצה פיפטה למאגר שבבים לחיבור קו צינור ואקום כדי 2 מ"מ קוטר פנימי.
- לרוקן את מאגרי ולשטוף את הערוץ (כמו בשלב 1) עם הידרוקסיד נתרן 1 מ 2 דקות. זה בעדינות etches קירות הערוץ, מניב בורוסיליקט משטח נקי כדי לעזור להקים תכונות משטח אחיד.
- רוקן מאגרי ונקי במים דה מיונן (DI), ואז לשטוף את הערוץ עם LE 2 דקות ~. במהלך תקופה זו מאפייני פני השטח וציפויים דינמיים לאזן בתוך הערוץ.
3. Fluorophore התמקדות השיא במצב ITP
- הכן 1 מ"ל LE בהיקף של 100 מ"מ HCl, 200 מ"מ טריס, ו PVP 1%.
- הכן 1 מ"ל TE בהיקף של 100 HEPES מ"מ ו 200 מ"מ טריס. שלב 90 μl של TE עם 10 μl של 1 מיקרומטר Alexa פלואוריד 488 (AF488).
- לאחר השטיפה עם LE כמתואר חלק 2, רוקן את מאגר המערבית לנקות כמה פעמים עם DI אודר לדלל כל LE שנותרו המאגר. למלא את המאגר עם 20 TE μL המכיל AF488.
- מניחים את האלקטרודה החיובית המאגר מזרח הקרקע (שלילי) אלקטרודה במאגר המערבית להחיל 2 μA (קבוע הנוכחי). השיא מדגם יעברו במהירות קבועה מן המאגר המערבית מאגר התיכון (ראה איור 1) ואת המתח בין מאגרים אלה יגדל מוליכות TE נמוך ממלא את הערוץ.
4. הפקת וטיהור של חומצות גרעין מ - א 'תרבותי coli
היכולת להתמקד באופן סלקטיבי מינים יוניים עושה ITP הטכניקה האידיאלית להכנת מדגם הביולוגי. אנו מטהרים חומצות גרעין של תא lysate מטופל על ידי בחירת אניון נגרר עם גודל ניידות אפקטיבי נמוך יותר מאשר חומצת גרעין אבל היעד גבוה יותר מאשר שיתוף יוניים מעכבי PCR (חומרי ניקוי anionic למשל, חלבונים, ממיסים אורגניים, גם אם הוא קיים בהייריכוז GH). קטיוני PCR מעכבי (כגון מתכות אלקליות וחלבונים קטיוני ודטרגנטים) להעביר בכיוון ההפוך וכך נותרים גם מאחור. ITP תמציות מתמקד חומצות גרעין יעד מן המאגר המדגם, תוך השארת איטי PCR-עיכוב מינים מאחורי (ראה איור 4).
- קבלת דגימה או תרבות א ' קולי תאים לצפיפות גדולה יותר מ -10 8 CFU / mL.
- מעבירים 1 תא התרבות מ"ל לתוך צינור בטוח נעילת microcentrifuge ו גלולה ידי צנטריפוגה ב 4000g דקות 6.
- מחדש להשעות גלולה במים 80 RNase ללא μL ולהוסיף 10 μL של lysing סוכן המורכב tricine 10 מ"מ, 10 mM BIS-טריס, 2 mM EDTA, 0.1% Triton-X, 5 מ"ג / מ"ל ליזוזים. מערבבים בעדינות דגירה במשך 5 דקות. בטמפרטורת החדר (פרוטוקול lysing עיבוד Bercovici et al. 11).
- הוסף 10 μL של הידרוקסיד M 1 נתרן להעלות את ה-pH lysate ל ~ 12.5. להניע בעדינות את הצינורית מעלה ומטה עדהפתרון מתברר, שבו lysing נקודת סיום.
- שלב 10 μL של lysate עם μL 90 tricine של 50 מ"מ ו 100 מ"מ BIS-טריס. פתרון זה יכול לשמש TE.
- הכן 1 מ"ל של LE בהיקף של 500 mM BIS-טריס, 250 מ"מ HCl, 1% PVP, ו 1X SYBR גרין השנייה. מלאו את השבב microfluidic עם LE כמתואר בחלק 3.
- על מנת לחלץ את חומצות גרעין מטוהרים לניתוח את שבב בעקבות ITP, להחליף את התוכן של המאגר במזרח עם PCR תואם LE המכילה BIS-50mm טריס, 25 מ"מ HCl, ו -0.1% PVP. החל 1000 V בין מזרח ומערב בארות להתחיל את הניסוי. הנוכחי בין מאגרים אלה יקטן.
- בסוף הניסוי מדגם elutes אל תוך המאגר LE. ביחד עם elution זה, הפעם מול הנוכחי של מערכת זו בדרך כלל מגיע לערך הרמה (מאז ההתנגדות נשלטת כיום על ידי יוני טה מפוזרים באופן אחיד בתוך הערוץ). בעדינות מערבבים את המאגרתוכן על ידי חזרה על pipetting ולחלץ בנפח 5 μL לניתוח כמותי על ידי RT-PCR.
5. הפרדה של חומצות אמינו עם קטיוני הרמה במצב ITP ולא התמקדות נותב (NFT אזור) להדמיה
ITP ניתן להשתמש כדי להפריד ולהתמקד יונים קטנות לתוך מישורים הסמוך להבחין בין TE ו LE. זה מאפשר איתור וזיהוי מבוסס על מאפייני physicochemical, כגון מוליכות המקומית, ספיגת UV, חישה הטמפרטורה, או אינדקס השבירה. כאן אנו מראים שאינם מתמקדים נותב (NFT אזור) assay שם ניאון, שיתוף יונית מינים מתווסף LE. מין זה אינו מתמקד ניאון, אבל הריכוז שלו מתאים את עצמו לשדה החשמלי המקומי ובכך מאפשר הדמיה של אזורי מישור מטוהרים (ראה איור 5).
- הכן 1 מ"ל LE המורכב ethanolamine 100 מ"מ, 200 tricine מ"מ, ו 1% PVP, ו 100 מיקרומטר של 6G fluorophore קטיוני Rhodamine. <li> הכן 1 מ"ל TE בהיקף של 20 מ"מ טריס, tricine 40 מ"מ. הכן את המדגם על ידי ערבוב של 90 μL TE μL עם 10 כל אחד ארגינין 50 מ"מ ו 50 מ"מ ליזין.
- לוותר על 20 LE μL במערב מאגרי מצפון מדגם במאגר במזרח. החל אבק על מאגר דרום דקות 1.
- יש לשטוף היטב עם המזרח DI ולהחליף TE (TE ללא מדגם).
- החל 500 V בין מזרח ומערב מאגרים.
6. נציג תוצאות
אנחנו מראים isotachopherograms ניסויים מצב השיא ב 2 ב איור ו גרעין החילוץ ניסויים חומצה באיור 4. בניסויים מצב שיא עם הכתב ניאון (למשל AF488, SYBR הירוק ב '), עוצמת הקרינה הכוללת ניתן לשלב והשווה כנגד עקומת כיול כדי להשיג מידע ריכוז כמותי. 12 בנוסף, בניסויים מיצוי גרעין חומצה, מדגם מותר elute את לאהוא LE מאגר והוציא עם טפטפת לניתוח כמותי על ידי RT-PCR. 10,12 אנחנו מראים מצב isotachopherograms מישור להפרדה חומצת אמינו באיור 5. עוצמת הקרינה (יחסית LE או עוצמת אזור TE) יכול לשמש לזיהוי אזור, בעוד רוחב אזור לאפשר quantitation.
באיור 1. Isotachophoresis (ITP) היא טכניקה electrokinetic להשתמש ביישומים microfluidic לגילוי ההפרדה רגיש של יונים. ITP מציע ההפרדה, תוך התמקדות סלקטיבית, ויכולות preconcentration. כמו כן, היא החזקה ביותר רגיש להפרעות פיזיות בגלל האופי העצמי חידוד שלה. יונים מדגם סלקטיבי מתמקדים בין האלקטרוליט מובילה (LE) ונגררים (TE) ולנסוע דרך microchannel במהירות קבועה נקבע לפי מהירות של יוני המובילים באזור LE. לדוגמה יוניםאם למקד את הניידות electrophoretic יעיל שלהם בתוך סוגריים על ידי ניידות יעילה של יוני לה טמפ ו TE. סכמטית מתאר ITP מודל ניסוי שבו מדגם מתמקדת ללא הרף בין LE אזורי te.
איור 2. מדולל יונים מוקד מדגם ב ITP "הפסגה מצב". א) שני ברורה לדלל (ג << מדגם C LE) מוקד מינים במצב שיא על הממשק שנוצר בין LE אזורי te. רק LE ו TE לקבוע את השדה החשמלי, כמו מינים מדגם לא תרומה משמעותית הנוכחי. יונים לדוגמא מעורבבים עם TE (הזרקת חצי אינסופי) ולהתמקד יחד השיא גאוס בקירוב על הממשק ITP. הקריטריון התמקדות (כפי שניתן לראות אי שוויון) חלה על מינים מיוננים מאוד. ב) ניסויים שהראו Alexa פלואוריד 488 (AF488) התמקד במצב שיא עבור מגוון של זרמים שימושית (ראה גם Video 1). שיא רוחב המדגם הוא ביחס הפוך הנוכחי (על פיזור advective זניח בשל זרימת electroosmotic). 14 ממשק עצמית חידוד הוא עמיד בפני פיזור בשל זרימת לחץ מונחה (ראה וידאו 2).
3. איור לדוגמה יונים במוקד ריכוז גבוה מספיק "מצב הרמה" והם חלים על מוליכות המקומית. אנחנו בדרך כלל להציג את יוני הדוגמה הזרקת סופית בין TE ו LE. בין בצורתה זו, יונים מדגם נפרד והסדר על פי ניידות electrophoretic יעיל שלהם (ראו וידאו 3). עבור מינים מיוננים מאוד, TE ו מישור ריכוזים אזור נקבעים על ידי פונקציית ויסות Kohlrausch (KRF, סט משתנה תחילה על ידי אזור LE). יונים לדלל ממשיכים להתמקד במצב שיא בין bracketing הרמה אזורי ניידות יעילה שלהם. התמקדות גriterion (כפי שניתן לראות אי שוויון) חלה על מינים מיוננים מאוד.
איור 4. Lysate הכנת והפקת חומצות גרעין עם ITP במצב שיא. חומצות גרעין מופק א ' תא קולי התרבות באמצעות ליזוזים בסיוע lysing אלקליין מטוהרים על ידי התמקדות בררנית electrophoretic דרך ITP. TE מעורבב עם lysate (חום) מכיל חומצת גרעין היעד (ירוק), חלבונים, ו-PCR פוטנציאליים עיכוב chemistries. הבחירה המתאימה של נגרר והמובילה יונים מאפשר התמקדות סלקטיבית של חומצת גרעין היעד תוך השארת מעכבי ה-PCR מאחור. שיא סה"כ גרעין ITP חומצה לוקח בדרך כלל בצורה לא אידיאלית, כפי שמוצג כאן תמונת השיבוץ. כהפגנה של assay זה, אנו חילוץ חומצות גרעין הכולל חיידקים גראם שליליים, Escherichia coli (lysed פתרון סודיום הידרוקסיד לבד), מטוהרים במכורים אנונימיים מ lysate באמצעות ITP, אסףחילוץ החומר הגנטי, וביצע qRT-PCR ניתוחים לאמת טיהור מוצלח של 16S rRNA (אדום) ו 16S rDNA (ירוק) של התרבות חיידקים. שליליות סף שליטה מחזורים של rDNA 16S rRNA (כחול) ו 16S (צהוב) היו כל אחד מעל 30 מחזורים. ביצענו qRT-PCR באמצעות כוח SYBR גרין RNA ל-C T 1-Step קיט מ יישומי Biosystems עם 150 ננומטר קדימה (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) ולהפוך (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primers, על התנאים המומלצים רכיבה תרמית.
איור 5. ללא התמקדות נותב (NFT אזור) assay להפרדה וזיהוי של חומצות אמינו ללא תוויות. א) סכמטי של assay NFT אזור. הזרקת סופי של יונים מדגם מוחדר ערוץ המזרח. אנחנו מערבבים את LE עם fluorophore נותב קטיוני עם ניידות אפקטיבית נמוכה יותר מאשר יונים טה (נותב μ <μ TE). Fluorophoreהוא אמר לשמש "נותב underspeeding". כמו fluorophore electromigrates מ LE לאזורי הכבושים עכשיו על ידי מישורים מדגם TE, הוא חווה את השדה החשמלי גבוה יותר, וכך גדל ריכוזו. שינוי זה יוצר ריכוז הפעולות isotachopherogram. ב) ההפרדה של שתי חומצות אמינו, ארגינין וליזין, באמצעות assay NFT אזור עם 6G Rhodamine כמו נותב underspeeding ניאון. שיא קטן בין TE ו ארגינין נפוצה ITP, אינה מובנת היטב, וכאן לא מפריע גילוי או לכימות מישורים.
סרט משלים 1. לחץ כאן כדי להציג את הסרט משלים .
סרט משלימה 2. לחץ כאן כדי להציג את הסרט משלים .
סרט משלימה 3. לחץ כאן כדי להציג את הסרט משלים .
Discussion
השיטות ITP שהוצג לאפשר זיהוי מהיר, רגיש, ויציב וטיפול מולקולות יוניים. האתגר העיקרי בשימוש ITP היא בחירה נכונה של מאגרים לה טמפ ו TE. ב ITP anionic, אנחנו בדרך כלל לבחור כלוריד כמו אניון מובילה כי היא חומצה חזקה עם הניידות המוחלטת גבוהה מאוד, ולכן יש מאפיינים מאוד לחיזוי. לכן, הבחירה חיץ anionic ITP הוא מופחת בדרך כלל בחירה נכונה TE counterion. עבור ניסויים התמקדות סלקטיבית, בחירה TE הוא קריטי כדי הרחקה של זיהום יונים. ביישומים שבהם מזהמים אינם נוכחים, נמוך ניידות TE יעיל מוביל לשיעור מהיר יותר של התמקדות. אנו ממליצים להשתמש הבאות, יחסית מחונך anionic יונים טה: MES, מגבים, HEPES, tricine. הבחירה של counterion משפיע הן pH מערכת וניידות TE יעיל. Counterions נפוצים הם טריס (pKa 8.1) ו-BIS טריס (pKa 6.4). מבחני הדורשים pH נמוך או גבוה, מומלץ פירידין (pKa 5.25) וethanolamine (pKa 9.5), בהתאמה. בלוחות 1 ו -2, עבור ITP anionic קטיוני, בהתאמה, אנו מסכמים כמה דוגמאות חיץ שימושיים. אנחנו לוקחים HCl כמו יון נתרן LE anionic וכפי קטיוני LE יון, ואנחנו מניחים 100 כוח יונית מ"מ למאגר LE.
הקורא יהיה לציין כי יונית מאגר כוח הפרוטוקולים שלנו (וגם לוחות 1-2) תמיד גדול או שווה ל 10 מ"מ. אמנם באופן תיאורטי את הפיסיקה של ITP חל על כוח יונית נמוך 10 מ"מ, מזהמים טבעיים (חומצה פחמתית למשל מתגובה בין מים דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה) ליד רמה 1 mM לעתים קרובות להגביל את השימוש המעשי של מאגרים נמוכים כוח יוניים.
נציין, כי מנגנון התמרה האות אינו מוגבל מבחני שהוצגו בפרוטוקול זה. כפי שנאמר בקצרה חלק 5, במצב הרמה מטוהרים אזורי ניתן לאתר באמצעות שינוי המוליכות המקומי, absor UV, טמפרטורה bance, או אינדקס השבירה. בקבוצה שלנו, פיתחנו שיטה אשר מנצל ampholytes הספק ניאון לאיתור זיהוי רגיש של analytes ידוע. 5 בניסויים מצב שיא, בדיקות ספציפיות ניתן לתייג analytes ממוקדים. בדוגמה אחת, אנו משתמשים באלומות מולקולריות - בדיקות oligonucleotide כי לזרוח על ההכלאה רצף היעד שלהם - כדי לזהות DNA היעד או מולקולות רנ"א עם סגוליות גבוהה 11,18.
בעוד ITP היא איתנה יחסית פיזור הנגרמת על ידי זרימת הלחץ מונע EOF, EOF מוגזמת עלולה לגרום לקיפאון של ממשק ITP, שם מהירות EOF אומר הופך שווה למהירות ITP. 14 EOF חזקה כזו מתרחשת בעיקר בתנאים של pH גבוה וחוזק יוני נמוך. מסיבה זו, אנו ממליצים על שימוש מאגרים עם pH 8 או נמוך יותר ועם כוח יונית בסדר גודל של 100 מ"מ, אם נוח. מניסיוננו, PVP הואביותר ציפוי יעיל לדיכוי EOF שבבי בורוסיליקט. עם זאת, בגלל המאפיינים שלה סנון, PVP לא יכול להיות מתאים עבור יישומים מסוימים, כגון התמקדות הדנ"א הגנומי. בניסויים, אנו צופים כי התוספת של PVP יכול לצמצם במידה ניכרת את ניידות הדנ"א הגנומי המוחלט (עד כדי כך שהוא לא מתמקד). במקרים אלה ציפוי silanol כגון Sigmacote ב conjuction עם פעילי שטח (למשל טריטון X-100) יכול להיות גם יעיל בהפחתת EOF. 10
| TE אניון (pKa -1) | ||||
| Counterion חציצה (pKa 1) | MES (6.10) | מגבים (7.20) | HEPES (7.50) | tricine (8.15) |
| ethanolamine (9.50) | 21.41 | 20.40 | 17.38 | 22.85 |
| טריס (8.08) | 21.00 | 19.23 </ Td> | 15.84 | 17.56 |
| BIS-טריס (6.40) | 18.22 | 10.41 | 7.30 | 5.23 |
| פירידין (5.18) | 1.01 | 3.72 | 2.42 | 1.48 |
טבלה 1. ניידות גודל אפקטיבי (× 10 -9 מ '2 / V / s) של אזור מותאם אנליטי טהור ITP anionic שם LE הוא 100 מ"מ HCl ו 200 חציצה counterion מ"מ.
| TE קטיון (pKa 1) | ||||
| Counterion חציצה (pKa -1) | ethanolamine (9.50) | טריס (8.08) | BIS-טריס (6.40) | פירידין (5.18) |
| MES (6.10) | 35.57 | 21.96 | 16.39 | 10.45 |
| MOPS (7.20) | 35.47 | 20.92 | 9.76 | 3.93 |
| HEPES (7.50) | 35.35 | 19.97 | 7.77 | 2.88 |
| Tricine (8.15) | 34.77 | 16.72 | 4.50 | 1.44 |
טבלה 2. גודל ניידות אפקטיבית (× 10 -9 מ '2 / V / s) של אזור מותאם אנליטי טהור ITP קטיוני שבו LE הוא 100 מ"מ ו 200 נתרן חציצה counterion מ"מ.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו בתודה להכיר במימון DARPA פוקוס בחסות מיקרו / ננו יסודות fluidics (MF3) מרכז תחת חוזה מספר N66001-10-1-4003, ומן DARPA מענק N660001-09-C-2082.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled water | GIBCO, by Life Technologies | 10977 | RNase/DNase free |
| Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt Baker Inc. | 7708 | |
| hydrochloric acid (HCl) | EMD Millipore | HX0603-4 | |
| Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences, Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
| tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
| bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| EDTA | GIBCO, by Life Technologies | AM9260G | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
| ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
| Rhodamine 6G | Acros Organics | CAS 989-38-8 | |
| L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
| Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
| Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
| Vacuum pump | Gast Manufacturing, Inc. | DOA-P104-AA | |
| Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
| Inverted epifluorescent microscope | Olympus Corporation | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
| Filter cube | Omega Engineering, Inc. | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
| Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5mL capacity |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417C | |
| Table 3. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis. Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).
- Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis. Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).
- Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications. Elsevier Science & Technology. , (1976).
- Khurana, T. K., Santiago, J. G. Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers. Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).
- Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water. Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).
- Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay. Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).
- Kaigala, G. V. Miniaturized system for isotachophoresis assays. Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).
- Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).
- Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis. Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).
- Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis. Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).
- Bercovici, M. Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons. Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).
- Marshall, L. A., Santiago, J. G. Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis. Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).
- Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers. Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).
- Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Sample dispersion in isotachophoresis. J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).
- Kohlrausch, F. Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen. Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).
- Alberty, R. A. Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases. J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).
- Jovin, T. M. Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations. Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).
- Persat, A., Santiago, J. G. MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons. Anal. Chem. , (2011).
