Summary
ダニ媒介性病原体が病気を引き起こす方法感染したダニの体液のコレクション、唾液腺、唾液は勉強することが重要です。このプロトコルでは、餌から体液と唾液腺を収集する方法を示しています
Abstract
ダニは世界中に存在し、多くのダニ媒介性疾患を持つ人間を苦しめるされています。ダニはライム病とダニ媒介性回帰熱（ ボレリア属）、ロッキー山紅斑熱（ ロッキー山紅斑熱リケッチア ）、エーリキア症（ エールリヒアchaffeensisとE.エクイ ）、アナプラズマ病（ アナプラズマphagocytophilum）、脳炎（ダニの原因となる病原体のベクトルです。媒介性脳炎ウイルス）、バベシア症（ バベシア属）、コロラドダニ熱（Coltivirus）と、野兎病（ 野兎病菌 ）1-8。適切にホストに送信するこれらの感染性病原体は、差動、遺伝子発現を調節する目盛りのタンパク質と相互作用し、ダニ3,9-13を通して移行します。たとえば、ライム病剤、 ボレリアburgdorferiはは 、ダニの風土病サイクル14,15の祝宴と飢饉段階に差動遺伝子発現を介して適応します。また、 マダニティックとしては、消費吸血ボレリアは、唾液腺に移動すると追放された唾液9,16-19を使用してホストに送信され血体腔、腸内から複製と移行します。
ダニが供給されたホストは、通常、強力な止血及び先天性免疫応答11,13,20-22で応答します。これらのホストの応答にもかかわらず、I.ダニの唾液が3,11,20,21,23を供給するダニを支援するために免疫であるタンパク質、溶解剤、抗凝固剤、及びfibrinolysinsが含まれているため、scapularisは数日間供給できます。ダニの唾液や唾液腺抽出物（SGE）が保有する免疫調節活性は、多数のダニ媒介性病原体3,20,24-27の送信、増殖、普及を促進します。それは積極的に摂食ダニを分析し、ダニの唾液を収集することが不可欠である、さらにダニ媒介性感染症の病気を引き起こす方法を理解する。このビデオプロトコルは、解剖の技術を示しています体液の収集と積極的にIを供給から唾液腺の除去48時間および72時間後にマウスを配置した後scapularisニンフ。また、成人女性Iから唾液採取を実証scapularisダニ。
Protocol
1。スライドの準備のために体液のコレクション
（動画1）
- 穏やかに表面殺菌に10分間、5分間、その後70％エタノールで3％、局所過酸化水素の動物や場所からダニを供給積極的に削除します。
- PAPペンでシランコーティングされた顕微鏡スライド上に円を描くとPAPペンサークル内での目盛りを配置します。
- シランコートしたスライドは、顕微鏡スライドに体液の最高の遵守のために使用されます。
- 解剖顕微鏡（1X目的、10X接眼レンズ、3.5X倍率）の下の目盛りを表示します。
- そっとダニの足をスプレーしてダニを固定するためにピンセットでダニの背を下に押します。
注：これは腸または穿刺のダニを破壊し、体液を汚染する可能性があるため、ダニを固定するときはあまりにもハードキーを押さないでください。
- 目でダニの足や足を切断使い捨てメス細かい点を持つe遠位関節。体液を介して感染を決定するために1つだけの脚は切断する必要があります。体液のコレクションのために、スライド上の複数の脚は切断されることがあります。
注：これは体液の中腸の汚染を引き起こす可能性があるため、体に近すぎて足を切断しないでください。
- 脚や足が切断された後、穏やかにスライド上に足を外に分泌する体液のために目盛りの背に圧力をかけ続けています。穏やかに体液を広げるために、スライド上の周りにダニを移動します。
2。唾液腺の除去
（映画2＆3）
- リン酸塩のスポットいくつかの25μlのプールは、顕微鏡スライド上に緩衝生理食塩水（PBS）とPBSプールのいずれかに目盛りを配置します。
- 解剖顕微鏡（1X目的、10X接眼レンズ、3.5X倍率）の下の目盛りを表示します。
- 微細な先端forcepとダニを安定させる基礎頭状花（口の部分）やダニの後部を押したままだ。
- ダニの背面に微細な先端鉗子を挿入し、臓器を公開するダニの背をスライス。必要に応じて中腸は、この時点で削除され、顕微鏡スライド上でPBSの新鮮なプールに、またはPBSを含むマイクロチューブに転送することができます。
- 両側ダニの足と一緒に位置して唾液腺（ブドウのようなクラスタ）のペアを見つける。唾液腺は、ダニの破片は、唾液腺の破壊や損失を低減するためにPBSの新鮮なプールには、まだ唾液腺を含む、主要な目盛りの部分を移動する間表示されていない場合。
注：彼らは、後に摂食のに比べて開発されていないため、以前の給餌では、唾液腺では見つけることが困難です。
- 微細な先端鉗子とPBSの新鮮なプール内の場所でダニから唾液腺を削除します。
- のWi細かいthは鉗子は、任意の外部の微生物やダニの残骸を削除するには、この洗浄ステップ3-4回以上繰り返し、別のきれいな25μlのPBSプールに唾液腺を転送するチップを渡した。
注：個々の唾液腺の損失と混乱を減らすために静かに唾液腺クラスタを洗浄します。
- シランコートスライド上またはPBSを含むマイクロチューブにPBSのきれいなプールに腺を配置します。
3。唾液採取
（動画4）
- 優しくウサギまたはそれらが完全に充血した、約5-7日後に添付ファイルをドロップオフ直前の細かい先端鉗子を使用して、他のホストから大人の女性のダニを削除します。
- スコッチテープで顕微鏡用スライドの一方の端を上にほぼ充血したダニを付着。テープは約配置する必要があります¾方法のTickの背の頭に向かって、ダニの基礎頭状花（口部分）が露出したまま。
- ここで、テープが5％ピロカルピン溶液のダニ背面のピペットを5μl（メタノール中）の前縁を満たしています。テープはピロカルピンは、ダニの基礎頭状花に接触させることなく、ダニの背の上にピロカルピンを芯することができます。
- 顕微鏡スライド上に非毒性粘土の作品ダニの口器から約1インチをマウントします。
- 微細な先端鉗子を使用して所望の直径にプルキャピラリーチューブ28の先端を折ります。
- 解剖顕微鏡下でダニの基礎頭状花を表示します。
- 優しく上顎palpsは、毛細管の外側に存在することができ引っ張らキャピラリーチューブにダニの口円錐に合わせて。
- 代わりに、毛細管を保持するために粘土にキャピラリーチューブの反対側の端を押してください。
- 高湿度（例えば、濡れたPAPが並んで蓋付き発泡スチロールのボックスを暗室内にマウントされた垂涎の目盛りを配置する ERのタオル）。重力は、唾液採取を支援することができ、口円錐指すように容器の底にスライドを傾けます。
- 室温で容器を置きます。
- 密接に最初の1時間は垂涎ダニを監視し、それはパスツールピペットの電球とキャピラリーチューブの外に排出することによって生成される唾液を収集します。最初の一時間後に、少なくとも4時間は蓄積時間ごとにチェックマークを付けます。それが生成される唾液を収集し続けています。
注：十分な唾液が実行されて研究のために収集されると、唾液の収集が停止することができます。
- ダニは垂涎されていない場合、または複数の唾液が必要な場合は、流涎が時折口円錐をマッサージしてキャピラリーチューブを用いて誘導することができます。
- 必要になるまで-80℃で唾液や店舗℃にプロテアーゼ阻害剤カクテル0.1ボリュームを追加します。
4。代表的な結果
e_contentは、 ">ムービー1は、部分的に供給I. scapularisニンフを保持し、顕微鏡スライド上に体液を収集するために足を切断する方法を示しています。脚または足が透明な液体が（図1Aおよび1B）分泌され、切断されたら。もし腸体液はそのまま曇りが表示され切断した脚（S）（図1Cおよび1D）から出てくる破裂しています。ニンフは、48時間または72時間のために供給された後、唾液腺の抽出は、映画の2および3に示されています。ダニ後の破片の多く（気管、マルピーギ管から成る、血液、結合組織など）がPBSの新鮮なプールに目盛りを移動する唾液腺の損失や中断を防ぐために、一般的にはありパンクである。ニンフは、オープンカットされた後に唾液腺が置かれている図2Aおよび2Bは、図2Cは、PBSのプールで唾液腺のクラスタを削除示しています。
I.から設定唾液採取scapularis成人女性Iのは、映画4および図3に示す。キャピラリーチューブに垂涎の目盛りは、映画5で観察される。唾液コレクションのこのメソッドは、唾液分泌を刺激すると成人女性の目盛り当たりの唾液20μlを介して得ることができますピロカルピン使用されます。
I. scapularisニンフの図1。ラベル付けされた構造。
ムービー1。 マダニscapularis体液コレクションは映画を見るにはここをクリックしてください 。
図2は汚染されていない（＆B）とニンフの脚から滲出（C＆D）体液を汚染。
映画（2）48時間飼育I.からの唾液腺抽出scapularisニンフ。pload/3894/3894movie2.aviは、 ">映画を見るにはここをクリックしてください。
72時間飼育I.からムービー3。唾液腺抽出scapularisニンフ。 映画を見るにはここをクリックしてください 。
図3 マダニscapularisニンフ唾液腺。 （＆B）抽出に先立って、72時間給餌ニンフの唾液腺の例は、。 （C）唾液腺のクラスタを削除しました。
大人のI.から設定ムービー4。唾液採取scapularis雌ダニ。 映画を見るにはここをクリックしてください 。
大人のI.から図4唾液採取scapularis女性トンicks。 （＆B）粘土によって保持されて毛細管のunpulled端とキャピラリーチューブの引き上げ最後に、その口円錐のスライド上にマウントされているチェックを入れます。よだれ大人I.を含んでいる （C＆D）加湿チャンバーscapularis女性チック。
映画5。キャピラリーチューブによだれscapularis雌ダニのマダニ 。 映画を見るにはここをクリックしてください 。
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Discussion
ダニの体液、唾液腺、唾液のコレクションはダニ媒介性病原体の伝播の研究に重要であり、有病率、普及、増殖、目盛り、およびホスト6,11-13,20,23,29両方の持続性。目盛り30,31を分析する方法はいくつかあります。しかし、唾液腺を収集するときに唾液腺が破裂したり、ダニの遺骨が失われないように適切に目盛りを細かくすることが重要です。唾液腺は、それらが腸の汚染を除去し、その後唾液腺抽出物（SGE）を取得するためにPBSで染色または接地用スライド上に固定することができます数回洗浄する必要がダニから削除されたら。 SGEは、唾液よりも収集することが容易で、唾液に類似した属性を持っているので、それは唾液の代替として使用することができます。しかし、SGEは、ダニの唾液中に存在しない唾液腺細胞由来の付加的なタンパク質を含んでいます。 SGEできるB内の余分なタンパク質のほか電子利点または実行されている調査に応じて不利ですが、研究者がSGEで作業する際に注意する必要があるものです。 SGEは、ピロカルピンは唾液腺の収集時に使用されていないという利点を持っています。ピロカルピン、救いのアゴニストとして作用するムスカリン性コリン様作用剤は、Bの細胞毒性効果を有することが示されている唾液採取32,33間にブルグドルフェリ 。ドーパミンは、流涎の別のアゴニストであるが、持続効果33を有するピロカルピンに比べて急速に、体液や他のダニの体液によって破壊されています。他の刺激の技術は唾液収集のために検討されているとすべてが唾液成分34に影響を及ぼすことが示された。
ダニが動いている、それが腸を破裂させずにそれらを固定するために問題となる可能性がありますので、体液の収集が困難な場合があります。両面テープでダニを固定するオプションが、HEMOです。ダニが削除されていない場合、リンパ節は、テープに失われる可能性があります。他の研究では、遠位関節にダニの足を切断し、体液16,35を収集するために遠心分離を使用して複数のダニから体液を採取しています。体液コレクションは体液がダニの感染性を決定するために用いることができるマスターされれば、病原体の相互作用にチェックし、唾液腺に腸から病原体の移行。
我々の研究室の焦点は、BであるがブルグドルフェリとI. scapularisダニは、このプロトコルに記載されている技法は、他のダニ媒介性の感染性病原体とダニ種を研究するために使用することができます。さらに、これらの技術は比較的容易にニンフ、大人でも使用できます。幼虫で、これらの技術を使用すると、そのサイズのために挑戦することができます。解剖技術が習得されるまで、それが感染していないダニを使用することを推奨します。感染を解剖したときには、適切なバイオセーフティ対策を行使することも重要であるテッドまたはフィールドには、ダニを集めました。このビデオプロトコルのメソッドは、目盛りの解剖と、それらのテクニックを実行するときに探すためにを実施する方法のガイドラインとして使用することができます。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、マウスやウサギの彼らの手入れや、保守のために特別にベクトルを媒介とする疾病の動物資源支店の部門、アンドレアソン、リサマスウーディー、ヴァーナ·オブライエン、ジョン·リデルに感謝します。また、この原稿に向かって彼らの貢献のためにエイミー·ウルマン、テレサ·ラッセル、バーバラJ.ジョンソンに感謝します。最後に、この原稿の撮影に関連付けられているすべての合法性を導くためのグラフィックイラストやジュディ·ラヴェルを製造するためのCDCのコミュニケーションのためのアソシエートディレクターのオフィスでアリッサ·エッカートを確認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H312-500 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| Dumont Fine forceps (3C) | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| Silane treated microscope slides | Bioworld | 42763007-1 | |
| Pap pen | Bioworld | 21750008-1 | |
| Super frost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| Pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| #11 disposable scalpel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| Nontoxic modeling clay | Fisher Scientific | S17307 | |
| Capillary tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
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