Summary
Die Sammlung von infizierten Zecke Hämolymphe, Speicheldrüsen, und Speichel ist wichtig, zu untersuchen, wie durch Zecken übertragene Erreger eine Krankheit verursachen. In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie man Hämolymphe und Speicheldrüsen von der Fütterung sammeln
Abstract
Zecken sind weltweit und plagen die Menschen mit vielen Zecken-übertragene Erkrankungen. Zecken sind Vektoren für Krankheitserreger, die Lyme-Borreliose und Frühsommer-Rückfallfieber (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted Fever (Rickettsia rickettsii), Ehrlichiose (Ehrlichia chaffeensis und E. equi), Anaplasmose (Anaplasma phagocytophilum), Enzephalitis (tick-verursachen Meningo-Enzephalitis-Virus), Babesiose (Babesia spp.), Colorado Zeckenbissen (Coltivirus) und Tularämie (Francisella tularensis) 1-8. Um richtig in den Wirt übertragen werden diese Erreger unterschiedlich die Genexpression regulieren, interagieren mit Zecken-Proteine und wandern durch die Zecke 3,9-13. Zum Beispiel, passt sich die Lyme-Borreliose-Agent, Borrelia burgdorferi, durch differentiellen Genexpression zu dem Fest und Hungersnot Stadien der Zecke enzootischen Zyklus 14,15. Darüber hinaus verbraucht als ein Ixodes Zecken einBlutmehl Borrelia replizieren und wandern aus dem Mitteldarm in die Haemocoel, wohin sie wandern in die Speicheldrüsen und werden in den Wirt mit dem Speichel vertrieben 9,16-19 übertragen.
Wie eine Zecke führt der Host antwortet in der Regel mit einer starken hämostatischen und angeborene Immunantwort 11,13,20-22. Trotz dieser Wirtsreaktionen, I. scapularis kann für mehrere Tage zu ernähren, da Zecken Speichel enthält Proteine, die immunmodulatorische sind, lytische Mittel, Antikoagulanzien und fibrinolysins, die Zecke 3,11,20,21,23 Fütterung zu helfen. Die immunmodulatorischen Aktivitäten von Zeckenspeichel oder Speicheldrüsen-Extrakt (SGE) besessen zu erleichtern Übertragung, Vermehrung und Verbreitung von zahlreichen Zecken übertragenen Krankheitserregern 3,20,24-27. Um weiter zu verstehen, wie durch Zecken übertragene Erreger eine Krankheit verursachen es wichtig, aktiv zu sezieren Fütterung Zecken und sammeln Zeckenspeichel ist. Dieses Video demonstriert Protokoll Dissektion Techniken fürdie Sammlung von Hämolymphe und die Entfernung der Speicheldrüsen von der aktiven Zuführen I. scapularis Nymphen nach 48 und 72 Stunden nach der Platzierung der Maus. Wir zeigen auch, Speichel Kollektion von einer erwachsenen Frau I. scapularis tick.
Protocol
1. Hämolymphe Sammlung der Präparation der Objektträger
(Movie 1)
- Vorsichtig entfernt aktiv Zuführen Zecken aus einem Tier und in 3% Wasserstoffperoxid topische für 5 Minuten und dann in 70% Ethanol für 10 Minuten an die Oberfläche zu sterilisieren.
- Mit einem Pap-Stift zeichnen Sie einen Kreis auf einem Silan beschichtete Objektträger und steckt die Zecke innerhalb der PAP PEN Kreis.
- Silan beschichtete Objektträger für die besten Einhaltung der Hämolymphe auf den Objektträger verwendet.
- Sehen Sie das Häkchen unter einem Binokular (1X Ziel, 10x Okular, 3,5 facher Vergrösserung).
- Drücken Sie vorsichtig auf der Zecke mit einer Pinzette zu Dorsum der Zecke die Beine spreizen und immobilisieren die Zecke.
Hinweis: Bei der Immobilisierung die Zecke nicht zu fest drücken, da dies die Punktion oder Mitteldarm der Zecke kann stören und verunreinigen das Hämolymphe.
- Amputieren der Zecke am Bein oder die Beine an the distale Gelenk mit einer feinen Spitze Einweg-Skalpell. Um die Infektiosität zu ermitteln via Hämolymphe nur ein Bein muss amputiert werden. Für Sammlung von Hämolymphe auf einer Folie mehrere Beine amputiert werden kann.
Hinweis: Schneiden Sie nicht das Bein zu nahe an den Körper, weil diese Mitteldarm Kontamination der Hämolymphe verursachen können.
- Nachdem das Bein oder die Beine abgeschnitten sind weiterhin üben Sie sanften Druck an der Zecke Dorsum für die Hämolymphe zur Sekretion aus den Beinen auf die Folie. Bewegen Sie das Häkchen um auf der Folie, um die Hämolymphe zu verbreiten.
2. Speicheldrüse Entfernung
(Filme 2 & 3)
- Spot 25 ul mehrere Pools von Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) auf einen Objektträger und legen einen Haken in eine der PBS-Pools.
- Sehen Sie das Häkchen unter einem Binokular (1X Ziel, 10x Okular, 3,5 facher Vergrösserung).
- Stabilisieren Sie die Zecke mit feinen Spitzen forceps, indem Sie die Basis Capitulum (Mundwerkzeuge) oder den hinteren Teil der Zecke.
- Legen Sie die feinen Pinzetten in die hintere der Zecke und in Scheiben schneiden bis die Zecke ist Dorsum, um die Organe freizulegen. Falls gewünscht kann der Mitteldarm zu diesem Zeitpunkt entfernt werden und in ein frisches Pool von PBS auf einem Objektträger oder einem Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS.
- Finden Sie das Paar Speicheldrüsen (Traube-wie Cluster) bilateral neben den Beinen der Zecke befinden. Wenn die Speicheldrüsen sind nicht unter die Zecke Trümmer bewegen Sie den wichtigsten Teil Tick, immer noch mit den Speicheldrüsen, in ein frisches Pool von PBS, um die Störung und Verlust der Speicheldrüsen reduzieren sichtbar.
Hinweis: Frühere in einer Fütterung sind die Speicheldrüsen schwieriger zu lokalisieren, weil sie nicht so weit entwickelt sind als im Vergleich zu einem späteren Zeitpunkt in der Fütterung.
- Entfernen Sie die Speicheldrüsen der Zecke aus mit feinen Pinzetten und in ein frisches Pool von PBS.
- With feinen Pinzetten übertragen Sie die Speicheldrüsen zu einem anderen sauberen 25 ul PBS-Pool, wiederholen Dieser Waschschritt 3-4 weitere Male, um alle externen Mikroorganismen und Zecken zu entfernen.
Hinweis: Waschen Sie die Speicheldrüse Cluster sanft, um den Verlust und die Störung der einzelnen Speicheldrüsen zu reduzieren.
- Platzieren Sie die Drüsen in einem sauberen Pool von PBS auf einem mit Silan beschichtete Folie oder in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS.
3. Speichelsammlung
(Movie 4)
- Entfernen Sie vorsichtig erwachsene weibliche Zecken aus dem Kaninchen oder anderen Host mit feinen Pinzetten, kurz bevor sie abfallen sich prall an, etwa 5-7 Tage nach der Befestigung.
- Beachten Sie die fast engorged Tick auf das eine Ende eines Objektträgers mit Tesafilm. Das Band sollte etwa platziert werden ¾ der Weg nach oben der Zecke Rücken in Richtung des Kopfes, so dass der Zecke Grundlage Capitulum (Mundwerkzeuge) ausgesetzt.
- Wo die Band den vorderen Rand der Zecken Dorsalfläche Pipette 5 ul 5% Pilocarpin-Lösung (in Methanol) erfüllt. Lassen Sie das Band, um das Pilocarpin über die Zecke Dorsum Docht, ohne dass das Pilocarpin in Kontakt mit der Zecke Grundlage Capitulum kommen.
- Bringen Sie ein Stück ungiftig Modelliermasse auf den Objektträger etwa einen Zoll von der Zecke Mundwerkzeuge.
- Mit feinen Pinzetten brechen Sie die Spitze eines beigezogenen Kapillarrohr 28 auf den gewünschten Durchmesser.
- Ansicht der Zecke Grundlage Capitulum unter einem Binokular.
- Sanften Sitz der Zecke Hypostom in die Kapillare gezogen so dass die oberen Palpen auf der Außenseite des Kapillarrohrs befinden.
- Drücken Sie die entgegengesetzten Ende des Kapillarrohrs in der Modelliermasse um das Kapillarrohr in Position zu halten.
- Stellen Sie das montierte salivating Zecke in einer dunklen Kammer mit hoher Luftfeuchtigkeit (z. B. ein Deckel Styroporbox mit nassen Brei gefüttert ER Handtücher). Drücken Sie den Träger so den Hypostom Punkten auf den Boden des Behälters, so dass die Schwerkraft beim Speichelprobe zu unterstützen.
- Stellen Sie den Behälter bei Raumtemperatur.
- Genau beobachten salivating Zecken für die erste Stunde, und sammeln Speichel, wie es durch Austreiben es aus der Kapillarröhrchen mit einer Pasteur-Pipette Glühbirne erzeugt wird. Nach der ersten Stunde, überprüfen Anhäufung jede Stunde für mindestens 4 Stunden. Weiter, um den Speichel, wie es erzeugt wird, zu sammeln.
Hinweis: Der Speichel Erwerb kann gestoppt werden, sobald genügend Speichel für die Prüfung durchgeführt wird, gesammelt werden.
- Wenn die Zecken sind nicht Speichelfluss oder wenn mehr Speichel benötigt wird, Speichelfluss kann gelegentlich mit der Kapillare eine Hypostom massieren induziert werden.
- Geben Sie 0,1 Volumina von Protease Inhibitor Cocktail auf die Speichel-und Speicher bei -80 ° C bis sie benötigt werden.
4. Repräsentative Ergebnisse
e_content "> Movie 1 veranschaulicht, wie eine nur teilweise eingezogenen I. scapularis Nymphe halten und die Beine amputieren, um Hämolymphe auf einen Objektträger zu sammeln. Sobald das Bein oder Beine amputiert werden eine klare Flüssigkeit abgesondert wird (Abbildung 1A und 1B). Wenn der Mitteldarm gebrochen wird die Hämolymphe erscheint trübe, wie es ist kommt aus dem amputierten Bein (e) (Abbildung 1C und 1D).Die Gewinnung von Speicheldrüsen nach der Nymphe hat sich für 48 oder 72 Stunden gefüttert wird in Filmen 2 und 3 gezeigt. Nachdem die Zecke punktiert wird es im Allgemeinen eine Menge Schutt (bestehend aus Luftröhre, Malpighischen Gefäße, Blut, Bindegewebe etc.) zu bewegen, um den Verlust oder die Störung der Speicheldrüsen der Zecke zu verhindern, um einen frischen Pool von PBS. 2A und 2B zeigen, wo die Speicheldrüsen befinden, nachdem die Nymphe aufgeschnittenen sind und 2C zeigt entfernt Speicheldrüse Cluster in einem Pool von PBS.
Speichelsammlung aus I festgelegt scapularis erwachsenen Weibchen i s in Film 4 und Abbildung 3 dargestellt. Ein Häkchen salivating in ein Kapillarrohr ist in Film 5 beobachtet. Diese Methode der Speichel-Auflistung verwendet, um den Speichelfluss anzuregen Pilocarpin und kann über 20 ul Speichel pro erwachsene weibliche Zecke liefern.
Abbildung 1. Markierten Strukturen einer I. scapularis Nymphe.
Movie 1. Ixodes scapularis Hämolymphe Sammlung. Hier klicken, um Film zu sehen .
Abbildung 2. Nicht kontaminierte (A & B) und verunreinigt (C & D) Hämolymphe exsudierenden von der Nymphe Bein.
Movie 2. Speicheldrüse Extraktion aus einem 48 Stunden gefüttert I. scapularis Nymphe.pload/3894/3894movie2.avi "> Klicken Sie hier, um Film zu sehen.
Movie 3. Speicheldrüse Extraktion aus einem 72 Stunden gefüttert I. scapularis Nymphe. Klicken Sie hier, um Film zu sehen .
Abbildung 3. Ixodes scapularis Nymphe Speicheldrüsen. (A & B) Beispiele für Speicheldrüsen in 72 Stunden gefüttert Nymphe, vor der Extraktion. (C) entfernt Speicheldrüse Cluster.
Movie 4. Speichelsammlung up von einem erwachsenen I festgelegt scapularis weibliche Zecke. Klicken Sie hier, um Film zu sehen .
Abbildung 4. Speichelsammlung aus adulten I. scapularis weibliche tIcks. (A & B) Markieren auf einem Objektträger mit Hypostom in der ausgezogenen Ende des Kapillarröhrchens mit dem unpulled Ende des Kapillarrohrs durch Modelliermasse gehalten. (C & D) befeuchteten Kammer mit salivating erwachsenen I. scapularis weiblichen Zecken.
Movie 5. Ixodes scapularis weibliche Zecke salivating in ein Kapillarrohr. Klicken Sie hier, um Film zu sehen .
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Discussion
Die Sammlung von Zecken Hämolymphe, Speicheldrüsen, und Speichel ist in der Studie von Zecken übertragene Erreger Übertragung wichtig, Prävalenz, Verbreitung, Vermehrung und Persistenz sowohl in der Zecke und dem Host 6,11-13,20,23,29. Es gibt mehrere Möglichkeiten, um ein Häkchen 30,31 sezieren. Allerdings, wenn das Sammeln Speicheldrüsen ist es wichtig, die Zecke richtig, so dass die Speicheldrüsen nicht gebrochen oder verloren in der Zecke die Überreste zu sezieren. Sobald die Speicheldrüsen aus der Zecke sie benötigen, um mehrere Male gewaschen werden, um Verunreinigungen zu entfernen und Mitteldarm kann dann auf einen Objektträger zur Färbung oder Boden in PBS auf Speicheldrüsen-Extrakt (SGE) zu erhalten befestigt werden entfernt. SGE ist einfacher ist, als Speichel und besitzt Attribute Ähnliche Speichel, daher kann sie als eine Speichelprobe alternativ verwendet werden. Allerdings enthält SGE zusätzliche Proteine, die aus den Speicheldrüsen Zellen, die nicht vorhanden sind, in Zeckenspeichel. Die Zugabe von zusätzlichen Proteinen in SGE can be ein Vorteil oder ein Nachteil, je nach Studie durchgeführt, sondern ist etwas, ein Forscher muss sich bewusst sein, der bei der Arbeit mit SGE. SGE hat den Vorteil, dass Pilocarpin nicht während der Erfassung von Speicheldrüsen verwendet. Pilocarpin, ein muskarinischer cholinomimetische Mittel, das als ein Agonist der Rettung wirkt, hat sich gezeigt, einen zytotoxischen Effekt auf B haben burgdorferi während Speichelentnahme 32,33. Dopamin ist ein weiterer Agonist des Speichelfluss, sondern schnell über die Hämolymphe und andere Flüssigkeiten Tick zerstört, im Vergleich zu Pilocarpin das hat eine nachhaltige Wirkung 33. Andere stimulierende Techniken zur Sammlung Speichel untersucht worden und alle wurden gezeigt, um die Speicheldrüsen Zusammensetzung 34 zu beeinflussen.
Hämolymphe Sammlung kann schwierig sein, weil die Zecken in Bewegung sind und es kann problematisch sein, um sie ohne Zerreißen der Mitteldarm immobilisieren. Immobilisierung die Zecke mit doppelseitigem Klebeband ist eine Option, aber die HämoLymphknoten kann auf das Band verloren, wenn der Tick nicht entfernt wird. Andere Studien haben Hämolymphe von mehreren Zecken gesammelt, indem das Häkchen die Beine an den distalen Gelenken und mittels Zentrifugation zu sammeln der Hämolymphe 16,35. Sobald Hämolymphe Sammlung gemeistert wird die Hämolymphe benutzt werden, um Zecken Infektiosität zu ermitteln, zu ticken Pathogen-Interaktionen, und die Migration der Erreger aus dem Mitteldarm in die Speicheldrüsen.
Obwohl unser Labor konzentriert sich auf B. burgdorferi und I. scapularis Zecken, die Techniken in diesem Protokoll erwähnt lassen sich auch andere durch Zecken übertragene Krankheitserreger studieren und Zeckenarten werden. Darüber hinaus können diese Techniken auch auf Nymphen oder Erwachsene mit relativer Leichtigkeit verwendet werden. Mit Hilfe dieser Techniken mit Larve könnte eine Herausforderung sein wegen ihrer Größe. Bis die Dissektionstechnik gemeistert wird ist es besser, nicht infizierten Zecken verwenden. Es ist auch wichtig, um die richtigen Maßnahmen Biosicherheit ausüben, wenn Sezieren InfektionenTed oder Feld gesammelten Zecken. Die Methoden in diesem Video-Protokoll kann als Leitlinien für die Durchführung Tick Dissektionen und worauf Sie beim Durchführen dieser Techniken aussehen verwendet werden.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich bei der Aufteilung des Vector-Borne Diseases Animal Resources Abteilung bedanken, speziell Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O'Brien, John Liddell und für ihre Pflege und Wartung der Mäuse und Kaninchen. Wir möchten auch an Amy Ullmann, Theresa Russell, und Barbara J. Johnson für ihre Beiträge zu diesem Manuskript danken. Schließlich möchten wir Alissa Eckert in das Amt des Associate Director für Kommunikation an der CDC anerkennen für die Herstellung der grafischen Darstellungen und Judy Lavelle zum Lenken alle Gesetzmäßigkeiten mit den Dreharbeiten zu dieser Handschrift verbunden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H312-500 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| Dumont Fine forceps (3C) | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| Silane treated microscope slides | Bioworld | 42763007-1 | |
| Pap pen | Bioworld | 21750008-1 | |
| Super frost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| Pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| #11 disposable scalpel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| Nontoxic modeling clay | Fisher Scientific | S17307 | |
| Capillary tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
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