Summary
La colección de la hemolinfa garrapata infectada, las glándulas salivales y la saliva es importante para estudiar la forma transmitida por garrapatas patógenos causan enfermedades. En este protocolo se demuestra cómo recoger las glándulas salivales y la hemolinfa de la alimentación
Abstract
Las garrapatas se encuentran en todo el mundo y afectan a los seres humanos con muchas enfermedades transmitidas por garrapatas. Las garrapatas son vectores de patógenos que causan la enfermedad de Lyme transmitida por garrapatas y la fiebre recurrente (Borrelia spp.), Rocky Mountain la fiebre manchada (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia equi chaffeensis y E.), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encefalitis (por garrapatas virus de la encefalitis transmitida), babesiosis (Babesia spp.), la fiebre de Colorado (Coltivirus), y la tularemia (Francisella tularensis) 1-8. Para ser transmitido de forma adecuada en el huésped estos agentes infecciosos regular la expresión génica diferencial, interactuar con las proteínas de garrapatas, y migran a través de la garrapata 3,9-13. Por ejemplo, el agente de la enfermedad de Lyme, Borrelia burgdorferi, se adapta a través de la expresión génica diferencial a las etapas de escasez y abundancia de ciclo enzoótico de la garrapata 14,15. Además, como una garrapata Ixodes consume unaharina de sangre de Borrelia replicarse y migrar del intestino medio en el hemocele, donde viajan a las glándulas salivales y se transmiten en el huésped con la saliva expulsada 9,16-19.
Como una garrapata se alimenta del huésped por lo general responde con una fuerte respuesta inmune innata y hemostático 11,13,20-22. A pesar de estas respuestas de acogida, I. scapularis pueden alimentarse durante varios días debido a saliva de la garrapata contiene proteínas que son inmunomoduladores, agentes líticos, anticoagulantes y fibrinolysins para ayudar a alimentar la garrapata 3,11,20,21,23. Las actividades inmunomoduladoras que poseen saliva de la garrapata o extracto de las glándulas salivales (SGE) facilitan la transmisión, la proliferación y difusión de numerosos patógenos transmitidos por garrapatas 3,20,24-27. Para entender mejor cómo transmitida por garrapatas agentes infecciosos causan la enfermedad es esencial para diseccionar alimentando activamente garrapatas y recoger saliva de la garrapata. Este protocolo vídeo muestra la técnica de disección dela recogida de hemolinfa y la eliminación de las glándulas salivares de manera activa la alimentación I. scapularis ninfas después de 48 y 72 horas después de la colocación del ratón. También demuestran la toma de saliva de un adulto I. femenina scapularis garrapatas.
Protocol
1. Hemolinfa colección para la preparación de diapositivas
(Película 1)
- Suavemente eliminar activamente las garrapatas de alimentación de un animal y el lugar en el peróxido de hidrógeno al 3% tópica durante 5 minutos y luego en etanol al 70% durante 10 minutos para esterilizar la superficie.
- Con una pluma de Papanicolaou dibujar un círculo sobre un portaobjetos recubierta de silano y coloque la garrapata dentro del círculo de la pluma de Papanicolaou.
- Silano portaobjetos revestidos se utilizan para la mejor adherencia de la hemolinfa al portaobjetos de microscopio.
- Ver la garrapata con un microscopio de disección (1X objetivo, ocular 10X, la magnificación de 3.5X).
- Empuje suavemente hacia abajo en el dorso de la garrapata con unas pinzas de splay patas de la garrapata y la inmovilización de la garrapata.
Nota: Cuando la inmovilización de la garrapata no presionar demasiado fuerte porque esto puede afectar el intestino o la punción de la garrapata y contaminar la hemolinfa.
- Amputar la pierna de la garrapata o las patas ºe distal conjunta con una punta fina desechables bisturí. Para determinar la infectividad a través de la hemolinfa sólo una pierna tiene que ser amputada. Para la recolección de la hemolinfa en un portaobjetos de varios tramos puede ser amputada.
Nota: No corte la pierna demasiado cerca del cuerpo, porque esto puede causar la contaminación del intestino medio de la hemolinfa.
- Después de la pierna o piernas se cortan seguir aplicando presión suavemente a dorso de la garrapata de la hemolinfa de secretar fuera de las patas en la diapositiva. Suavemente mueva alrededor de la garrapata en la diapositiva para difundir la hemolinfa.
2. Extirpación de la glándula salival
(Cine 2 y 3)
- Spot varias piscinas de 25 l de tampón fosfato salino (PBS) sobre un portaobjetos de microscopio y se coloca una marca en una de las piscinas de PBS.
- Ver la garrapata con un microscopio de disección (1X objetivo, ocular 10X, la magnificación de 3.5X).
- Estabilizar la garrapata con pinza de punta finas manteniendo la cabezuela base (partes de la boca) o la parte trasera de la garrapata.
- Inserte las pinzas de punta fina en la parte posterior de la garrapata y el tramo hasta que la garrapata es el dorso de exponer los órganos. Si se desea, el intestino medio puede ser eliminado en este momento y se transfiere a una piscina fresca de PBS en un portaobjetos de microscopio o de un tubo de microcentrífuga que contiene PBS.
- Encuentra el par de glándulas salivales (como racimos de uva), ubicado al lado de las piernas bilateral de la garrapata. Si las glándulas salivales no son visibles entre los escombros garrapata mover la parte principal de la garrapata, que todavía contiene las glándulas salivales, a un grupo fresco de PBS para reducir los trastornos y pérdida de las glándulas salivales.
Nota: A principios de la alimentación, las glándulas salivales son más difíciles de localizar porque no están tan desarrolladas como en comparación con el más adelante en la alimentación.
- Retire las glándulas salivales de la garrapata con unas pinzas de punta fina y el lugar en una piscina fresca de PBS.
- Wiª de punta fina pinza de transferencia de las glándulas salivales a otra limpia 25 l grupo PBS, repita este paso de lavado 3-4 veces más para eliminar los microorganismos externos y los restos de garrapata.
Nota: Lavar las agrupaciones de las glándulas salivales suavemente para reducir la pérdida y alteración de las glándulas salivales individuales.
- Colocar las glándulas en una piscina limpia de PBS en un portaobjetos recubierta de silano o en un tubo de microcentrífuga que contiene PBS.
3. La saliva recogida
(Película 4)
- Retire con cuidado garrapatas hembras adultas de conejo o de otro host usando unas pinzas finas con punta justo antes de que caen apagado totalmente llena de sangre, días aproximadamente 5-7 después de la fijación.
- Pegue la garrapata cerca de hinchada en un extremo de un portaobjetos con cinta adhesiva. La cinta debe estar colocada aproximadamente a ¾ de su altura dorso de la garrapata hacia la cabeza, dejando cóndilo de la garrapata base (partes de la boca) expuestos.
- Cuando la cinta se encuentra con el borde anterior de la superficie dorsal garrapatas pipeta 5 ml de solución de pilocarpina 5% (en metanol). Permitir la cinta para absorber la pilocarpina sobre el dorso de garrapata, sin permitir que la pilocarpina para entrar en contacto con cabezuela base de la garrapata.
- Montar un trozo de plastilina no tóxica en el portaobjetos de un microscopio de aproximadamente una pulgada de piezas bucales de la garrapata.
- Utilizando unas pinzas de punta fina rompa la punta de un tubo capilar sacó 28 al diámetro deseado.
- Ver cóndilo de la garrapata base bajo un microscopio de disección.
- Suavemente encajar hipostoma de la garrapata en el tubo capilar sacó permitiendo que los palpos maxilares para residir en el exterior del tubo capilar.
- Presione el extremo opuesto del tubo capilar en la arcilla de modelado para mantener el tubo capilar en su lugar.
- Coloque la garrapata montada la boca agua dentro de una cámara oscura con una alta humedad (por ejemplo, una caja de poliestireno con tapa forrada con pap húmeda er toallas). Al girar el portaobjetos para que los puntos hipostoma a la parte inferior del recipiente, permitiendo que la gravedad para ayudar en la recogida de la saliva.
- Poner el recipiente a temperatura ambiente.
- Vigilar de cerca las garrapatas salivando durante la primera hora, y recoger la saliva como se genera mediante la expulsión fuera de los tubos capilares con un bulbo de pipeta de Pasteur. Después de la primera hora, visita acumulación cada hora durante al menos 4 horas. Continuar para recoger la saliva, ya que se genera.
Nota: la adquisición de la saliva puede detener una vez suficiente saliva se recoge en el estudio que se realiza.
- Si las garrapatas no están salivando o si se requiere más saliva, salivación en ocasiones puede ser inducida mediante el tubo capilar para masajear el hipostoma.
- Añadir 0,1 volúmenes de cóctel inhibidor de la proteasa a la saliva y almacenar a -80 ° C hasta que se necesite.
4. Los resultados representativos
e_content "Película> 1 muestra cómo llevar a cabo una parte alimenta la ninfa I. scapularis y amputar las piernas para recoger la hemolinfa en un portaobjetos de microscopio. Una vez que la pierna o piernas son amputadas de un líquido claro es secretada (Figura 1A y 1B). Si el intestino medio se rompe la hemolinfa aparece turbia como lo es sale de la pierna amputada (s) (Figura 1C y 1D).La extracción de las glándulas salivares después de la ninfa ha estado alimentando durante 48 ó 72 horas se demuestra en las películas 2 y 3. Después de la garrapata es perforado en general hay una gran cantidad de desechos (que consta de tráquea, malpigiana túbulos, sangre, tejido conjuntivo, etc), para evitar la pérdida o alteración de las glándulas salivales mover la garrapata a una piscina fresca de PBS. Las figuras 2A y 2B muestran en las glándulas salivales se encuentran después de la ninfa ha sido abierto y 2C figura muestra eliminado grupos de glándulas salivales en un charco de PBS.
La obtención de saliva crearse a partir de I. las hembras adultas scapularis i s se muestra en la película de 4 y la figura 3. Una garrapata salivando en un tubo capilar se observa en la película 5. Este método de extracción de saliva utiliza la pilocarpina para estimular la salivación y puede producir más de 20 l de saliva por la garrapata hembra adulta.
Figura 1. Las estructuras con etiqueta de una ninfa I. scapularis.
Película 1. Colección de Ixodes scapularis hemolinfa. Haga clic aquí para ver la película .
Figura 2. No contaminados (A y B) y contaminados (C + D) hemolinfa exudado de la pierna de la ninfa.
Película 2. Extracción de las glándulas salivales de un 48 horas alimentados I. scapularis ninfa.pload/3894/3894movie2.avi "> Haga clic aquí para ver la película.
Película 3. Extracción de las glándulas salivales de un 72 horas alimentados I. scapularis ninfa. Haga clic aquí para ver la película .
Figura 3. Glándulas salivales Ixodes scapularis ninfa. (A y B) Ejemplos de glándulas salivales en una ninfa de 72 horas alimentado, antes de la extracción. (C) Se ha eliminado del clúster glándula salival.
Colección de películas 4. La saliva configurar de un adulto I. garrapata hembra scapularis. Haga clic aquí para ver la película .
Figura 4. Colección de saliva de un adulto I. scapularis t mujeresIcks. (A y B) Marque montado en una diapositiva con su hipostoma al final sacó del tubo capilar con el fin unpulled del tubo capilar en manos de plastilina. (C + D) humidificado cámara que contiene agua la boca adulta I. scapularis garrapatas hembras.
Película 5. Ixodes scapularis garrapata hembra la boca agua en un tubo capilar. Haga clic aquí para ver la película .
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Discussion
La colección de la hemolinfa de garrapatas, las glándulas salivales y la saliva es importante en el estudio de la transmitida por las garrapatas transmisión del patógeno, la prevalencia, la difusión, la proliferación y persistencia, tanto en la garrapata y el anfitrión 6,11-13,20,23,29. Hay varias formas para disecar una marca 30,31. Sin embargo, en la recogida de las glándulas salivales es fundamental para diseccionar la garrapata correctamente por lo que las glándulas salivales no se rompen o se pierden en los restos de la garrapata. Una vez que las glándulas salivales se eliminan de la garrapata que necesitan ser lavado varias veces para eliminar la contaminación del intestino medio y, a continuación se puede fijar en un portaobjetos para la tinción o suelo en PBS para obtener extracto de glándula salival (SGE). SGE es más fácil de recoger que la saliva y posee características similares a la saliva, por lo que se puede utilizar como una alternativa la saliva. Sin embargo, la SGE contiene proteínas adicionales procedentes de las células de la glándula salival que no están presentes en la saliva de la garrapata. La adición de proteínas adicionales en SGE puede be una ventaja o una desventaja, dependiendo del estudio que se realiza, pero es algo que un investigador tiene que tener en cuenta cuando se trabaja con SGE. SGE tiene la ventaja de que la pilocarpina no se utiliza durante la recogida de las glándulas salivales. La pilocarpina, un agente muscarínico colinomimético que actúa como un agonista de la salvación, se ha demostrado que tienen un efecto citotóxico sobre B. burgdorferi durante la recogida de la saliva 32,33. La dopamina es otro agonista de la salivación, pero es rápidamente destruida por la hemolinfa y otros fluidos de garrapatas, en comparación a la pilocarpina que tiene un efecto sostenido 33. Otras técnicas de estimulación se han explorado para la recogida de la saliva y todo, se mostró a afectar a la composición de la saliva 34.
Colección de hemolinfa puede ser difícil porque las garrapatas se están moviendo y que puede ser problemático para inmovilizarlos sin romper el intestino medio. Inmovilización de la garrapata con cinta de doble cara es una opción, pero hemo de lalinfáticos se pueden perder en la cinta si la garrapata no se quita. Otros estudios han recogido la hemolinfa de las garrapatas varias cortando las piernas de la garrapata en las articulaciones distales y el uso de centrifugación para recoger la hemolinfa 16,35. Una vez recogida la hemolinfa se domina la hemolinfa se puede utilizar para determinar la infectividad tic, tic al patógeno, y la migración de los agentes patógenos del intestino a las glándulas salivales.
Si bien el foco de nuestro laboratorio es el B. burgdorferi y I. scapularis garrapatas, las técnicas mencionadas en este protocolo se puede utilizar para estudiar otras transmitidas por garrapatas agentes infecciosos y marque las especies. Además, estas técnicas también se puede utilizar en ninfas o adultos con relativa facilidad. El uso de estas técnicas con las larvas pueden ser un reto debido a su tamaño. Hasta que la técnica de disección se domina, se sugiere utilizar las garrapatas infectadas. También es importante el ejercicio de las adecuadas medidas de bioseguridad en la disección de la infecciónTed o de campo recogido garrapatas. Los métodos de este protocolo de vídeo se puede utilizar como directrices sobre cómo llevar a cabo disecciones de graduación y lo que debe buscar cuando se realizan estas técnicas.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la División de Transmitidas por Vectores de Enfermedades Animales de Recursos Rama, específicamente Andrea Peterson, Lisa Massoudi, O'Brien Verna y Juan Liddell para su cuidado y mantenimiento de los ratones y conejos. También nos gustaría dar las gracias a Amy Ullmann, Russell Teresa, y Barbara J. Johnson por su contribución hacia este manuscrito. Por último, queremos agradecer a Alissa Eckert en la Oficina del Director Adjunto de Comunicación de los CDC para la producción de las ilustraciones gráficas y Lavelle Judy para dirigir todos los aspectos legales relacionados con la filmación de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H312-500 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| Dumont Fine forceps (3C) | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| Silane treated microscope slides | Bioworld | 42763007-1 | |
| Pap pen | Bioworld | 21750008-1 | |
| Super frost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| Pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| #11 disposable scalpel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| Nontoxic modeling clay | Fisher Scientific | S17307 | |
| Capillary tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
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