Summary
في هذه المقالة، وقدم، كمية بسيطة، وتقارب مرحلة فحص السائل الالتقاط. هذا هو أسلوب موثوق بها على أساس التفاعل بين حبات مغناطيسية والبروتينات الموسومة (على سبيل المثال nanobodies) من ناحية، والتقارب بين بروتين المفتاحية والثانية، والبروتين المسمى (مثل فيروس شلل الأطفال) من جهة أخرى.
Abstract
في هذه المقالة، وقدم، كمية بسيطة، وتقارب مرحلة فحص السائل الالتقاط. بشرط أن يكون المفتاحية واحد من البروتين والمسمى بروتين آخر، لا يمكن تنفيذ هذا الأسلوب من أجل التحقيق في البروتين البروتين التفاعلات. لأنه يقوم على يد واحدة على الاعتراف من البروتين الموسومة بواسطة حبات الكوبالت المغناطيسي المغلفة و من ناحية أخرى على التفاعل بين المعلمة وبروتين بروتين معين 2 الذي يسمى. أولا، يتم خلط البروتينات المسماة والموسومة وحضنت في درجة حرارة الغرفة. تضاف حبات المغناطيسي، والتي تعترف علامة، ويتم فصل جزء محدد من البروتين المسمى من الكسر غير منضم باستخدام مغناطيس. ويمكن تحديد كمية البروتين المسمى التي يتم التقاطها بطريقة غير مباشرة عن طريق قياس إشارة من البروتين المسمى بقي في جزء غير منضم. الطور السائل ووصف تجربة التقارب مفيد للغاية عندما البروتينات تحويل متعلق بتكوين جزئي الحساسة والحمارعايد. ويتجلى في وضع وتطبيق فحص للتفاعل بين فيروس شلل الأطفال وفيروس شلل الأطفال الاعتراف nanobodies 1. فيروس شلل الأطفال منذ حساسة للتحويل متعلق بتكوين جزئي 2 عندما تعلق على سطح صلب (نتائج غير منشورة)، ويقتصر استخدام ELISA، وينبغي لذلك يفضل نظاما يستند إلى أن المرحلة السائلة. مثال على نظام المرحلة السائلة المستندة غالبا ما تستخدم في polioresearch 3،4 هو بروتين الصغيرة A-مناعي اختبار 5. على الرغم من هذا الاختبار أثبت تطبيقه، يقتضي وجود FC-هيكل، والذي هو غائب في nanobodies 6،7. ومع ذلك، وفرصة أخرى، ويمكن هذه مثيرة للاهتمام ومستقر واحد نطاق الأجسام المضادة 8 المهندسة بسهولة مع مختلف به. وتستخدم على نطاق واسع (له) 6 علامة يظهر تقارب لأيونات ثنائي التكافؤ مثل الكوبالت والنيكل أو، والتي يمكن عن دورهم تطلى بسهولة على حبات مغناطيسية. ونحن بالتالي وضعت هذه كمية بسيطةتقارب فحص القبض على أساس الخرز الكوبالت المغناطيسي المغلفة. وصفت فيروس شلل الأطفال مع 35 S لتمكين التفاعل دون عوائق مع nanobodies وتقديم كشف كمية ممكنة. الأسلوب السهل القيام بها ويمكن أن تنشأ مع انخفاض التكلفة، والذي تدعمه بمزيد من إمكانية حبات المغناطيسي تجديد بشكل فعال.
Protocol
المبدأ (A) ونظرة عامة على طريقة (B) وصفت في الشكل 1.
1. إعداد المخزن المؤقت
- إعداد ملزم / غسيل عازلة عن طريق إذابة فوسفات الصوديوم هيدروجين (50 ملم) وكلوريد الصوديوم (300 ملم) في مجال المياه وضبط درجة الحموضة إلى 8.0. وبالإضافة إلى ذلك إضافة توين 20 (0.01٪ (M / V) تركيز النهائي)، ميثيونين (2٪ (M / V) تركيز نهائي)، والزلال (0.1٪ (M / V) تركيز نهائي)، والتكيف مع حجم المطلوبة.
2. إعداد حبات مغناطيسية
إعداد حبات مغناطيسية وفقا لدليل التعليمات. لفترة وجيزة:
- Resuspend حبات المغناطيسي باستخدام دوامة.
- نقل، بالنسبة لكل عينة، 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي معلق (40 ملغ / مل) في أنبوب.
- جمع حبات مغناطيسية باستخدام مغناطيس، حتى طاف هو واضح (+ / - 30 ثانية) وإزالة طاف بعناية.
- غسلحبات مغناطيسية مرتين: resuspend الخرز في 150 ميكروليتر من تجليد الكتب / غسل العازلة. ترحيل حبات مغناطيسية إلى جانب واحد من أنبوب باستخدام مغناطيس حتى طاف هو واضح، وإزالة بعناية وطاف.
- استخدام 40 ميكرولتر من تجليد الكتب / غسيل العازلة، ولكل عينة، إلى resuspend الخرز (10 ملغ / مل).
3. تقارب التقاط الفحص
ملاحظة: لقياس النشاط الإشعاعي الخلفية (الكونية) (0٪ النشاط الإشعاعي)، يتم إضافة أي فيروس radiolabeled على عينة الرقابة 1. بدلا من ذلك، يتم إضافة حجم نفسه ملزم / غسل العازلة.
ملاحظة: يتم تعريف النشاط الإشعاعي 100٪ عن طريق التحكم 2 عينة التي تضاف جميع المكونات ما عدا nanobody. بدلا من ذلك، يتم إضافة حجم نفسه ملزم / غسل العازلة.
- جلب 2000 نسخة في الدقيقة من 35 S المسمى (β-الإشعاع) نوع الفيروس سلالة سابين 1 9، تضعف مع تجليد / غسيل العازلة إلى 80 ميكروليتر إلى لوحة microtiter 96-جيدا.
- إضافة 10 & Mش؛ لتر من تخفيف nanobody إلى الآبار.
- تخلط لمدة 10 ثوان باستخدام شاكر.
- تسمح هذه العينات لاحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اضافة 40 ميكرولتر من تعليق الخرز المغناطيسي غسلها واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، في ظل اهتزاز بشكل مستمر.
- فصل الخرز وطاف باستخدام مغناطيس ونقل طاف مسح في أنبوب.
4. قياس النشاط الإشعاعي
- تحويل 50 ميكرولتر من طاف من الخطوة 3.6 في قارورة العد.
- أضف 3 مل من السوائل ومزيج التلألؤ. قياس النشاط الإشعاعي في عداد β-التلألؤ.
5. إعادة تدوير الخرز
- جمع حبات المغناطيسي المستخدمة في الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 2 دقيقة أو حتى يتم الحصول على طاف واضح.
- إزالة طاف وresuspend حبات في 6 مل هيدروكسيد الصوديوم M 0.5.
- نقل تعليق على multiplأنابيب ه واحتضانها في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق.
- استخدام مغناطيس لجمع حبات مغناطيسية وإزالة طاف.
- إضافة 1 مل 2٪ SDS-حلا لكل أنبوب وresuspend باستخدام دوامة. تغلي خلال 5 دقائق.
- جمع الخرز وإزالة طاف. Resuspend حبات في 1 مل EDTA M 0.2 (الأس الهيدروجيني = 7).
- احتضان هذه الأنابيب في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق، ومرة أخرى، وإزالة طاف.
- إضافة 1 مل من الماء إلى كل أنبوب وresuspend الخرز. جمع الخرز وإزالة طاف. كرر هذه الخطوة يغسل مرتين.
- إزالة طاف وresuspend حبات في 1 مل حل ملي 10 2 كوكلي. وضع على شاكر لمدة 10 دقائق.
- إزالة طاف باستخدام مغناطيس لجمع الخرز وresuspend في 1 مل من تجليد الكتب / غسل العازلة.
- إزالة طاف وتغسل حبات مرتين باستخدام 1 مل من 20٪ (V / V) الايثانول
- Resuspend حبات في حجمها الأصلي من 20٪ (V / V) وآخرونhanol للحصول على حبات مجدد في تركيز 40 ملغ / مل.
6. تفسير النتائج
- وسوف تستخدم مراقبة عينة 1، والذي أضيف أي فيروس radiolabeled، لتصحيح النشاط الإشعاعي للخلفية، وإلى تعيين قيمة النشاط الإشعاعي 0٪. تعيين مستوى التحكم في نموذج 2، والذي لا يحتوي على nanobody وحيث بالتالي كل فيروس radiolabeled يبقى في طاف، حيث بلغت قيمة النشاط الإشعاعي 100٪.
- نسبة النشاط الإشعاعي في طاف (= 1٪) هي مقياس لهطول الأمطار العام (= 100 - 1٪) من فيروس radiolabeled من nanobody.
7. ممثل النتائج
وتظهر النتائج ممثل لهذا التقارب في فحص التقاط أرقام 2 و 3 و 4. في الشكل 2، يظهر تقارب من PVSS38C، محددة nanobody لفيروس شلل الأطفال،. تم اختبار تقارب من PVSS38C لمدة ثلاثة مستضدات مختلفة من poliovirus اللغة الأصلية هي: مستضد (N-المستضد)، الصاخب مستضد (H-المستضد) ومفارز 14S. N-مستضد هو الفيروس الذي هو المعدية سليمة. عندما يتم تسخين فيروس (20 دقيقة عند 56 درجة مئوية) أو تعلق على سطح صلب (نتائج غير منشورة)، والتشكل من التغييرات قفيصة، مما أدى إلى فقدان (جزئي) من الحمض النووي الريبي الفيروسية والبروتين قفيصة VP4، وفارغ تتشكل capsids التي تسمى ثم H-مستضدات. مفارز 14S هي وسيطة الجمعية. يتم التعرف على هذه المستضدات من قبل مجموعات مختلفة من الأجسام المضادة بعد التطعيم (10) وتملك الحواتم مختلفة لذلك ومواقع مستضدي. في الشكل ويمثل نسبة النشاط الإشعاعي وجدت في طاف بوصفها وظيفة من تركيز nanobody. ويمكن ملاحظة أن النشاط الإشعاعي في طاف من العينات التي تحتوي على الوحدات الصغرى 14S radiolabeled يتناقص مع زيادة تركيزات من PVSS38C nanobody. يمكن أن يترجم هذا على أنه زيادة في كمية من فيروس شلل الأطفال 14S مفارز يخدعnected إلى PVSS38C nanobody وبشكل غير مباشر إلى حبات مغناطيسية. ويمكن للاسر عيار (= تركيز nanobody اللازمة للقبض على 50٪ من فيروس radiolabeled) يحسب بيانيا كما 0.099 نانومتر. ويلاحظ أي تقارب من PVSS38C لمستضدي-N و H-مستضدي شكل من فيروس شلل الأطفال. من هذه البيانات يتم تفسيرها أن PVSS38C يتفاعل مع حاتمة التي موجود حصرا على الوحيدات 14S وليس على الشكلين مستضدي أخرى من فيروس شلل الأطفال.
لإثبات أن الخسارة من النشاط الإشعاعي من طاف ليست سوى نتيجة للتقارب محددة من nanobody نحو مستضدات لها، تم إجراء فحص نفسه مع Nb1، وهي ولدت nanobody ضد منظم والنسخي lrpB من sulfataricus Sulfolobus ومعروفة لديهم اي تفاعل مع أي مستضد فيروس شلل الأطفال. يظهر نتيجة لهذا الفحص في الشكل 3. كل فيروس radiolabeled يبقى في supernatants تبين أنه لا يوجد تفاعلNb1 ضد الأشكال المستضدية ثلاثة من فيروس شلل الأطفال.
تم اختبار استنساخ النتائج وفقا لتكرار التجربة لمجموعة من ثماني مرات لمدة nanobody معين (أي PVSP29F) في أيام مختلفة وبواسطة أشخاص مختلفين. وتظهر النتائج في الشكل 4. تم حساب قيمة متوسط نسبة النشاط الإشعاعي في طاف لكل تركيز nanobody ويتم تمثيلها في المراسلات مع الانحراف المعياري.
الشكل 1. نظرة عامة على مبدأ (A) وطريقة (ب) من الفحص. A.، صاحب الموسومة nanobodies التي تعترف على وجه التحديد لمستضد فيروس شلل الأطفال معينة سوف تكون قادرة على التفاعل مع حبات المغلفة الكوبالت المغناطيسي، وسوف يعجل هذا الفيروس المسمى بالإشعاع. تضاف nanobodies باء، صاحب المفتاحية لفيروس شلل الأطفال المسمى بالإشعاع والمحتضنة. الكوبالت المغلفة هي حبات مغناطيسيةوأضاف ويتم تنفيذ الفصل المغناطيسي للمستضد محدد / غير منضم. يتم قياس النشاط الإشعاعي من طاف ويمكن الحصول على كمية المستضد القبض عليه.
الشكل 2. القبض على الانجذاب المغناطيسي حبات من مستضدات فيروس شلل الأطفال من قبل مختلف PVSS38C nanobody. وتمثل نسبة النشاط الإشعاعي وجدت في طاف بوصفها وظيفة من تركيز PVSS38C. ويمكن لل14S يمكن العثور على وجود علاقة تركيز على الاستجابة، والتي تبين تفاعل PVSS38C مع حاتمة الحالي حصرا على 14S. دون تفاعل كبير مع N-، ولا يمكن الكشف عن H-مستضد، على الرغم من أن يلاحظ تافهة غير محددة الاستيلاء على تركيزات عالية جدا.
الشكل 3. القبض على الانجذاب المغناطيسي حبات من مستضدات فيروس شلل الأطفال من قبل مختلف Nb1 nanobody الشكل 2 ولذلك فقط بسبب تقارب محددة من nanobody نحو مستضدات لها.
الشكل 4. استنساخ للفحص. ويمثل قيمة متوسط نسبة النشاط الإشعاعي في طاف بوصفها وظيفة من تركيز nanobody. وتكررت التجربة ثماني مرات في أيام مختلفة وبواسطة أشخاص مختلفين. ويمثل الانحراف المعياري كما الأشرطة العمودية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في البروتوكول، يتم تعريف النشاط الإشعاعي للمستضد التفاعل مع nanobody مثل فقدان فيروس radiolabeled من طاف. ولذلك فإن كمية النشاط الاشعاعي عجلت (= 100 - 1٪) ويمكن تقدير (منضمة إلى حبات المغناطيسي) بطريقة غير مباشرة من النشاط الإشعاعي في طاف (= 1٪). من ناحية أخرى، فإنه من الممكن أيضا لقياس النشاط الإشعاعي من جزء محدد من عجلت من المستضد بطريقة مباشرة من قبل ويبلغ حجمه immunocomplexes من حبات مغناطيسية مع إيميدازول 500 ملم. وقد تجلى سابقا هو 11 أن هناك تطابق كامل بين مجموع النشاط الإشعاعي، ومجموع النشاط الإشعاعي وجدت في الكسور وطاف بيليه. ولذلك فمن المقبول وتوفير الوقت لقياس النشاط الإشعاعي للطاف. وصفت طريقة لشطف من immunocomplexes من حبات مغناطيسية بواسطة وآخرون THYS.، 2011 11.
APART من فيروس شلل الأطفال، ومن المعروف picornaviruses أخرى لتكون حساسة لسطح صلب الناجمة تحويل متعلق بتكوين جزئي، مثل سفح مهم اقتصاديا والفم فيروس المرض (FMDV) 2. يوصف تغيير في شكل وانخفاض تقارب ملزم للبروتينات بشكل عام بعد الربط إلى البلاستيك في الأدب 12. ويمكن لذلك الفحص يمكن استخدامها لتحقيق التفاعل بين البروتينات الأخرى التي تعتبر حساسة للتغيرات متعلق بتكوين جزئي، لرسم خرائط حاتمة، لتحديد كمية البروتينات مطوية بشكل صحيح، للكشف عن الشوائب بنية ذات الصلة خلال عمليات الإنتاج، لفحص سريع من خلال دفعات الإنتاج، ويمكن لتنقية العينات التي هي مزيج من البروتينات ترتبط ارتباطا وثيقا، والعديد من التطبيقات الأخرى لا بد من التفكير. توافر حبات مغناطيسية مختلفة مع تقارب لبه مختلف تدعم هذه الاحتمالات. على الرغم من واستخدمت تسميات المشعة في هذه التجارب، يمكن أن إشارات أخرىتنفذ لكشف وتحديد التفاعلات، مثل الأصباغ الفلورية 13،14. ويمكن تحليل عينات كثيرة خلال تجربة واحدة وأنه من الممكن لأتمتة الأسلوب. ويمكن بسهولة حبات المغناطيسي المستخدمة في هذا الاختبار يمكن إعادة استخدامها من قبل مجرد خطوة، غليان تجريد والتجديد، مما يجعل هذه وسيلة غير مكلفة. حتى الآن، لم خمسة من هذه الدورات تجديد من الخرز لن يؤثر على استنساخ من النتائج (البيانات لا تظهر).
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اعتباره وسيلة معينة، حيث يتم استخدام nanobodies المحددة التي تعترف فقط المستضد بهم، كما أنهم كانوا قادرين على التفاعل بشكل مختلف مع الفيروس المسبب للمرض وN-H-المستضدات والوحيدات 14S.
ويمكن أن نخلص إلى أن هذا الفحص القبض على تقارب باستخدام الخرز المغناطيسي هو مقايسة مع مجموعة واسعة من التطبيقات الممكنة التي يمكن الاعتماد عليها، بسيطة، والكمية، ومحددة، وتوفير الوقت وغير مكلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
المؤلفان بالشكر إلى موظفي إدارة التكنولوجيا الحيوية الصيدلية والبيولوجيا الجزيئية وPelsmacker خصوصا دي مونيك لإعداد هذا الفيروس المسمى المشعة. ونحن ممتنون للميركس إلين وHadewych Halewyck على ملاحظاتهم للاهتمام ومناقشات وBleeser دي جيريت لمساعدته في المختبر. وأيد هذا العمل من الناحية المالية من منحة OZR من جامعة بروكسل الحرة (OZR1807)، وvoor فون Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) ومنظمة الصحة العالمية (TSA 200410791). ليز Schotte زميل predoctoral من voor فون Vlaanderen Onderzoek Wetenschappelijk (FWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ’HiSafe’ 2 | PerkinElmer, Inc. | 1200 - 436 | Scintillation fluid |
References
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A.
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. The Immunoassay Handbook. , Third edition, Elsevier. (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
