Summary
I denne artikel, er en simpel, kvantitativ, flydende fase affinitetsindfangning analysen præsenteret. Det er en pålidelig teknik baseret på interaktionen mellem magnetiske perler og mærkede proteiner (f.eks nanobodies) på den ene side og affiniteten mellem den mærkede protein og et andet, mærket protein (f.eks poliovirus) på den anden.
Abstract
I denne artikel, er en simpel, kvantitativ, flydende fase affinitetsindfangning analysen præsenteret. Forudsat at et protein kan mærkes og et andet protein mærket, kan denne fremgangsmåde anvendes til undersøgelse af protein-protein interaktioner. Den er baseret på den ene side om anerkendelse af det mærkede protein ved kobolt coatede magnetiske perler, og på den anden side på samspillet mellem den taggede protein og et andet specifikt protein, der er mærket. Først er de mærkede og mærkede proteiner blandet og inkuberet ved stuetemperatur. De magnetiske perler, der genkender mærket, tilsættes, og den bundne fraktion af mærket protein separeres fra den ubundne fraktion ved hjælp af magneter. Mængden af mærket protein, som er fanget kan bestemmes på en indirekte måde ved at måle signalet af det mærkede protein forbliver i den ubundne fraktion. Den beskrevne flydende fase affinitetsassay er ekstremt nyttigt, når de konforme konvertering følsomme proteiner er røvayed. Udviklingen og anvendelsen af analysen er vist for samspillet mellem poliovirus og poliovirus anerkende nanobodies 1. Idet poliovirus er følsom over for konformationelle konvertering 2, når fæstnet til en fast overflade (ikke offentliggjorte resultater), er anvendelsen af ELISA begrænset, og en flydende fase system bør derfor foretrækkes. Et eksempel på en flydende fase system anvendes ofte i polioresearch 3,4 er den mikro-protein A-immunfældning test 5. Selvom denne test har bevist sin anvendelighed, kræver det en Fc-struktur, som er fraværende i de nanobodies 6,7. Men, som en anden mulighed, kan disse interessante og stabile enkelt-domæne antistoffer 8 let manipuleret med forskellige mærker. Den udbredte (His) 6-tag viser affinitet for divalente ioner, såsom nikkel eller cobalt, som kan på deres side kan let belægges på magnetiske perler. Vi har derfor udviklet denne simple kvantitativeaffinitetsindfangning assay baseret på cobalt belagte magnetiske perler. Poliovirus blev mærket med 35S at muliggøre uhindret interaktion med nanobodies og at foretage en kvantitativ påvisning mulig. Fremgangsmåden er let at udføre og kan etableres med en lav pris, hvilket er yderligere understøttet af muligheden for effektiv regenerering de magnetiske perler.
Protocol
Princippet (A) og en oversigt over fremgangsmåden (B) er afbildet i figur 1.
1. Fremstilling af pufferen
- Forbered Binding / vaskebuffer ved at opløse natriumdihydrogenphosphat (50 mM) og natriumchlorid (300 mM) i vand, og pH justeres til 8,0. Derudover tilsættes Tween 20 (0,01% (m / v) slutkoncentration), methionin (2% (m / v) endelig koncentration) og albumin (0,1% (m / v) endelig koncentration) og tilpasse sig til det påkrævede volumen.
2. Fremstillingen af de magnetiske perler
Forbered de magnetiske perler i henhold til brugsanvisningen. Kort:
- Resuspendere de magnetiske perler under anvendelse af en vortex.
- Overførsel for hver prøve. 10 ul af de resuspenderede magnetiske perler (40 mg / ml) i et rør
- Samle de magnetiske perler under anvendelse af en magnet, indtil supernatanten er klar (+ / - 30 sekunder) og fjern supernatanten omhyggeligt.
- Vaskmagnetiske perler to gange: resuspenderes perlerne i 150 pi Binding / vaskepuffer. Migrere de magnetiske perler til den ene side af røret ved hjælp af en magnet, indtil supernatanten er klar og fjern supernatanten.
- Anvendelse 40 ul Binding / vaskebuffer, for hver prøve, for at resuspendere perlerne (10 mg / ml).
3. Affinitetsindfangning Assay
Bemærk: For at måle (kosmiske) baggrunden radioaktivitet (0% radioaktivitet), er der ingen radioaktivt virus tilføjes til en kontrolprøve 1. I stedet er det samme volumen Binding / vaskebuffer tilsat.
Bemærk: 100% radioaktivitet er defineret af en kontrolprøve 2, som alle komponenter tilsættes undtagen nanobody. I stedet er det samme volumen Binding / vaskebuffer tilsat.
- Bringe 2000 cpm af 35S-mærkede (β-stråling) poliovirus Sabin-stamme type 1 9, fortyndes med Binding / vaskebuffer til 80 pi i en 96-brønds mikrotiterplade.
- Tilsæt 10 & mu, l nanobody fortynding til brøndene.
- Bland i 10 sekunder under anvendelse af en ryster.
- Tillader prøverne inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Tilsæt 40 gl af den vaskede magnetiske perler suspension og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur under konstant omrystning.
- Adskille perlerne, og supernatanten under anvendelse af en magnet og overføre den klarede supernatant i et rør.
4. Måling af radioaktiviteten
- Overfør 50 ul af supernatanten fra trin 3,6 i en optælling kolbe.
- Tilsæt 3 ml scintillationsvæske og blandes. Måle radioaktiviteten i en β-scintillationstæller.
5. Recirkulere perler
- Indsamle de brugte magnetiske perler i et rør og centrifugeres ved 500 xg i 2 minutter, eller indtil en klar supernatant opnås.
- Fjernes supernatanten og resuspender perlerne i 6 ml 0,5 M NaOH.
- Overfør suspensionen til multiple rør og inkuberes i et ultralydsbad i 5 minutter.
- Anvende magneter til at samle de magnetiske perler og fjern supernatanten.
- Tilsæt 1 ml 2% SDS-opløsning til hvert rør og resuspenderes ved hjælp af en hvirvel. Koge løbet af 5 minutter.
- Indsamle perlerne og fjern supernatanten. Resuspendere perlerne i 1 ml 0,2 M EDTA (pH = 7).
- Inkuber rørene i et ultralydsbad i 5 minutter og en gang mere, supernatanten fjernes.
- Tilsættes 1 ml vand til hvert rør og resuspender perlerne. Indsamle perlerne og fjern supernatanten. Gentage dette vasketrin to gange.
- Fjernes supernatanten og resuspender perlerne i 1 ml 10 mM CoCl2 opløsning. Sat på en ryster i 10 minutter.
- Fjern supernatanten under anvendelse af en magnet til at indsamle perlerne og resuspenderes i 1 ml bindingsbuffer / vaskebuffer.
- Fjern supernatanten og vask af perlerne to gange med 1 ml 20% (v / v) ethanol
- Resuspendere perlerne i deres oprindelige volumen af 20% (v / v) ethanol til opnåelse regenererede perler i en koncentration på 40 mg / ml.
6. Fortolkning af resultater
- Kontrolprøve 1, hvor der ikke radioaktivt mærket virus blev tilsat, vil blive anvendt til at korrigere for baggrunden radioaktivitet og indstille 0% radioaktiviteten værdi. Kontrolprøve 2, som ikke indeholder nanobody og hvor derfor alle radiomærkede virus forbliver i supernatanten, er angivet som 100% radioaktiviteten værdi.
- Den procentdel af radioaktivitet i supernatanten (= en%) er et mål for den samlede udfældning (= 100 - en%) af det radioaktivt mærkede virus, nanobody.
7. Repræsentative resultater
Repræsentative resultater for dette affinitetsindfangning assay er vist i figur 2, 3 og 4. I figur 2 er affiniteten af PVSS38C en nanobody specifik for poliovirus, vist. Affiniteten af PVSS38C blev testet for tre forskellige antigener fra poliovIrus: nativ antigen (N-antigen), Opvarmet-antigen (H-antigen) og 14S-underenheder. N-antigen er det intakte virus, der er infektiøse. Når virussen opvarmes (20 minutter ved 56 ° C) eller bundet til en fast overflade (ikke offentliggjorte resultater), konformationen af capsid ændringer resulterer i en (delvis) tab af det virale RNA og capsidproteinet VP4 og tom capsider dannes, som derefter kaldt H-antigener. 14S-underenheder er montage mellemprodukter. Disse antigener genkendes af forskellige sæt af antistoffer efter immunisering 10 og har derfor forskellige epitoper og antigene sites. I figuren procentdelen af radioaktivitet fundet i supernatanten er repræsenteret som en funktion af koncentrationen af nanobody. Det kan ses, at radioaktiviteten i supernatanten af de prøver, der indeholder radiomærkede 14S-underenheder falder med stigende koncentrationer af nanobody PVSS38C. Dette kan oversættes som en stigning i mængden af poliovirus 14S subunits contilsluttet til nanobody PVSS38C og indirekte til de magnetiske perler. Den indfangende titer (= koncentrationen af nanobody nødvendigt at fange 50% af radiomærket virus) kan grafisk beregnes som 0,099 nM. Ingen affinitet for PVSS38C for N-antigene og H-antigene form af poliovirus observeres. Ud fra disse data fortolkes som PVSS38C vekselvirker med en epitop, der udelukkende er til stede på 14S-underenheden og ikke på de to andre antigene former af poliovirus.
At påvise, at tabet af radioaktivitet fra supernatanten kun skyldes den specifikke affinitet af nanobody mod dens antigener, blev det samme assay udført med NB1 til en nanobody genereret mod lrpB transkriptionelle regulator af Sulfolobus sulfataricus og kendes ingen interaktion med en poliovirus-antigen. Resultatet af dette assay er vist i figur 3. Alle radiomærkede virus forbliver i supernatanterne viser, at der ikke er nogen reaktivitetNB1 mod de tre antigene former af poliovirus.
Reproducerbarhed af resultaterne blev testet ved at gentage forsøget i alt otte gange for en given nanobody (dvs. PVSP29F) på forskellige dage og af forskellige personer. Resultaterne er vist i figur 4. Middelværdien af den procentvise radioaktivitet i supernatanten blev beregnet for hver nanobody koncentration og er repræsenteret i overensstemmelse med standard afvigelse.
Figur 1. En oversigt over princip (A) og fremgangsmåden (B) af assayet. A. His-mærket nanobodies der specifikt genkender et bestemt poliovirus antigen vil være i stand til at interagere med cobalt-belagte magnetiske kugler og vil præcipitere den radioaktivt mærkede virus. B. His-mærkede nanobodies tilsættes radioaktivt mærket poliovirus og inkuberet. Cobalt-overtrukne magnetiske perler ertilsat, og magnetisk adskillelse af bundne / ubundet antigen udføres. Radioaktiviteten af supernatanten måles, og mængden af opfanget antigen kan udledes.
Figur 2. Magnetiske perler affinitetsindfangning forskellige poliovirus antigener ved nanobody PVSS38C. Procentdelen af radioaktivitet fundet i supernatanten er repræsenteret som en funktion af koncentrationen af PVSS38C. For 14S en koncentrations-respons-sammenhæng kan findes, som viser interaktionen af PVSS38C med en epitop alene er til stede på 14S. Ingen signifikant interaktion med N-eller H-antigen kan påvises, selv om en ubetydelig ikke-specifik optagelse ved meget høje koncentrationer er bemærket.
Figur 3. Magnetiske perler affinitetsindfangning forskellige poliovirus antigener ved nanobody NB1 figur 2 er derfor kun skyldes den specifikke affinitet af nanobody mod dens antigener.
Figur 4. Reproducerbarhed af assayet. Middelværdien af den procentvise radioaktivitet i supernatanten er repræsenteret som en funktion af koncentrationen af nanobody. Forsøget blev gentaget otte gange på forskellige dage og af forskellige personer. Standardafvigelsen er repræsenteret som lodrette streger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protokollen, der er radioaktiviteten af antigenet interagere med nanobody defineret som tabet af radiomærket virus fra supernatanten. Er mængden af udfældet radioaktivitet (= 100 - a%) (bundet til de magnetiske perler) kan vurderes på en indirekte måde ved radioaktiviteten i supernatanten (= en%). På den anden side er det også muligt at måle radioaktiviteten af det udfældede bundne fraktion af antigen i en direkte måde ved eluering af immunkomplekser fra de magnetiske perler med 500 mM imidazol. Det er tidligere påvist, 11, at der er et perfekt match mellem den totale mængde radioaktivitet og summen af radioaktivitet fundet i supernatanten og pelleten fraktioner. Det er derfor accepteres og tidsbesparende at måle radioaktiviteten i supernatanten. Fremgangsmåden til eluering af immunkomplekser fra de magnetiske perler er beskrevet af Thys et al., 2011 11.
Apart fra poliovirus, er andre picornavira kendt for at være følsomme over for fast overflade induceret konformationelle konvertering, ligesom den økonomisk vigtige mund-og klovesyge virus (FMDV) 2. Ændring af formen og reduktionen i bindingsaffiniteten af proteiner i almindelighed efter binding til plast er beskrevet i litteraturen 12. Assayet kan derfor anvendes til at undersøge interaktionen mellem andre proteiner, som er følsomme over for konformationelle ændringer, for epitopkortlægning for at definere mængden af korrekt foldede proteiner, til at screene for struktur beslægtede urenheder under fremstillingsprocesser, for hurtig screening af batch under produktion, kan til oprensning af prøver, som er blandinger af nært beslægtede proteiner og mange andre applikationer tænkes. Tilgængeligheden af forskellige magnetiske perler med affinitet for forskellige mærker understøtter disse muligheder. Selv radioaktive mærker blev anvendt i disse eksperimenter, andre signaler kanskal iværksættes for at detektere og kvantificere de interaktioner, som fluorescerende farvestoffer 13,14. Mange prøver kan analyseres under et forsøg, og det er muligt at automatisere metode. De magnetiske perler, der anvendes i dette assay kan let genanvendes ved blot en kogende, stripning og regenereringstrinnet, hvilket gør dette til en billig fremgangsmåde. Indtil dato, har fem af disse regenereringscykler af perlerne ikke påvirke reproducerbarheden af resultaterne (data ikke vist).
Desuden kan det betragtes som en specifik fremgangsmåde, eftersom specifikke nanobodies anvendes der kun genkender de antigen, som de var i stand til at interagere anderledes med poliovirus N-og H-antigener og 14S-underenheden.
Det kan konkluderes, at denne affinitetsindfangning under anvendelse af magnetiske perler er et assay med en bred række af mulige anvendelser, der er pålidelig, enkel, kvantitativ, specifik, tidsbesparende og billig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker personalet i afdelingen for Pharmaceutical Biotechnology and Molecular Biology og især Monique De Pelsmacker for udarbejdelsen af radioaktivt mærkede virus. Vi er taknemmelige for Ellen Merckx og Hadewych Halewyck for deres interessante bemærkninger og diskussioner og Gerrit De Bleeser for hans hjælp i laboratoriet. Dette arbejde blev støttet af en OZR tilskud på Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) og World Health Organization (TSA 200.410.791). Lise Schotte er en predoctoral Fellow af Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ’HiSafe’ 2 | PerkinElmer, Inc. | 1200 - 436 | Scintillation fluid |
References
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A.
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. The Immunoassay Handbook. , Third edition, Elsevier. (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
