Summary
In diesem Artikel wird eine einfache, quantitative, flüssigen Phase Affinität Capture-Assay vorgestellt. Es ist eine zuverlässige Technik auf der Wechselwirkung zwischen magnetischen Kügelchen und markierten Proteine (zB Nanokörper) einerseits und der Affinität zwischen dem markierten Protein und einem zweiten, markierten Proteins (zB Poliovirus) auf der anderen Seite.
Abstract
In diesem Artikel wird eine einfache, quantitative, flüssigen Phase Affinität Capture-Assay vorgestellt. Vorausgesetzt, dass ein Protein markiert werden kann und ein anderes Protein markiert, kann dieses Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen durchgeführt werden. Es wird einerseits auf der Erkenntnis des markierten Proteins durch Kobalt beschichteten magnetischen Kügelchen und auf der anderen Seite auf der Wechselwirkung zwischen dem markierten Proteins und einer zweiten spezifischen Protein, das markiert ist bezogen. Zuerst werden die markierten und markierte Proteine gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert. Die magnetischen Perlen, die das Tag zu erkennen, werden zugegeben und der Anteil an gebundenem markierte Protein wird aus der ungebundenen Fraktion mit Hilfe von Magneten getrennt. Die Menge an markiertem Protein, das erfasst werden auf eine indirekte Weise durch Messen des Signals des markierten Proteins blieb in der ungebundenen Fraktion bestimmt werden. Die beschriebene flüssige Phase Affinitätsassay ist extrem nützlich, wenn Konformationsänderung Umwandlung empfindliche Proteine Esel sindAyed. Die Entwicklung und Anwendung des Tests ist für die Interaktion zwischen Poliovirus und Poliovirus erkennen Nanobodies 1 demonstriert. Da Poliovirus ist empfindlich gegenüber Konformationskonversion 2, wenn an einer festen Oberfläche (unveröffentlichte Ergebnisse) befestigt ist, ist die Verwendung von ELISA begrenzt und eine flüssige Phase System sollten bevorzugt werden. Ein Beispiel einer flüssigen Phase System auch an den polioresearch 3,4 verwendet wird, ist die Mikro-Protein A-Immunpräzipitation Test 5. Auch wenn dieser Test seine Anwendbarkeit unter Beweis gestellt hat, bedarf es eines Fc-Struktur, die es in den Nanobodies 6,7 ist. Doch als eine weitere Gelegenheit, lassen sich diese interessante und stabile Single-Domain-Antikörper 8 leicht mit verschiedenen Tags konstruiert werden. Die weit verbreitete (His) 6-Tag Affinität für zweiwertige Ionen, wie Nickel oder Kobalt, das an der Reihe leicht auf magnetischen Kügelchen beschichtet sein zeigt. Wir haben deshalb diese einfache quantitativeAffinität Capture-Assay auf Kobalt beschichteten magnetischen Kügelchen basiert. Poliovirus wurde mit 35 S markiert, um ungehinderten Interaktion mit den Nanobodies ermöglichen und um eine quantitative Erfassung möglich. Das Verfahren ist einfach durchzuführen und kann mit geringen Kosten, die durch die Möglichkeit der wirksamen Regeneration der magnetischen Beads unterstützt wird festgelegt.
Protocol
Das Prinzip (A) und ein Überblick über die Verfahren (B) sind in 1 dargestellt.
1. Vorbereitung der Puffer
- Bereiten Binding / Waschpuffer durch Auflösen von Natriumdihydrogenphosphat (50 mM) und Natriumchlorid (300 mM) in Wasser und den pH-Wert auf 8,0. Zusätzlich fügen Tween 20 (0,01% (m / v) Endkonzentration), Methionin (2% (m / v) Endkonzentration) und Albumin (0,1% (m / v) Endkonzentration) und stellen Sie die gewünschte Lautstärke ein.
2. Herstellung der magnetischen Beads
Bereiten Sie die magnetischen Kügelchen nach der Bedienungsanleitung. Kurz gesagt:
- Resuspendieren magnetische Kügelchen mit einem Vortex.
- Übertragen, für jede Probe 10 ul der resuspendierten magnetischen Kügelchen (40 mg / ml) in ein Rohr.
- Sammeln Sie die magnetischen Beads mittels eines Magneten, bis der Überstand klar ist (+ / - 30 sec) und entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
- Waschen Sie diemagnetischen Beads zweimal: Dynabeads in 150 ul Binding / Wash-Puffer. Migrieren Sie die magnetischen Kügelchen zu einer Seite des Rohres mit Hilfe eines Magneten, bis der Überstand klar ist und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Verwenden Sie 40 ul Binding / Waschpuffer, für jede Probe, um die Perlen (10 mg / ml) resuspendieren.
3. Affinity Capture Assay
Hinweis: Um die (kosmische) Hintergrund Radioaktivität (0% der Radioaktivität) zu messen, nicht radioaktiv markierten Virus ist mit einer Steuereinheit Probe 1 aufgenommen. Stattdessen wird das gleiche Volumen Binding / Waschpuffer zugesetzt.
Anmerkung: 100% der Radioaktivität wird durch eine Kontrollprobe 2, an dem alle Komponenten mit Ausnahme des Nanobody hinzugefügt definiert sind. Stattdessen wird das gleiche Volumen Binding / Waschpuffer zugesetzt.
- Bringt 2000 cpm von 35 S markierten (β-Strahlung) Poliovirus Sabin-Stamm Typ 1 9, mit Binding / Wash-Puffer auf 80 ul in einer 96-Well Mikrotiterplatten verdünnt.
- Fügen Sie 10 & mu; l Nanobody Verdünnung in die Vertiefungen.
- Mischen Sie etwa 10 Sekunden lang mit einem Shaker.
- Man lässt die Proben für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
- In 40 ul des gewaschenen magnetischen Beads Suspension und Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln.
- Trennen der Kügelchen und der Überstand unter Verwendung eines Magneten und übertragen die geklärte Überstand in ein Rohr.
4. Messung der Radioaktivität
- Übertragen Sie 50 ul der Überstand aus Schritt 3.6 in einem Kolben zu zählen.
- 3 ml Szintillationsflüssigkeit und mischen. Messen Sie die Radioaktivität in einem β-Szintillationszähler.
5. Das Recycling der Perlen
- Sammeln der verwendeten magnetischen Kügelchen in ein Rohr und Zentrifuge bei 500 × g für 2 Minuten oder bis eine klare Überstand erhalten wird.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 6 ml 0,5 M NaOH.
- Überführt die Suspension Multiple Rohre und inkubieren Sie in einem Ultraschallbad für 5 Minuten.
- Nutzen Sie die Magneten, die magnetische Kügelchen sammeln und den Überstand entfernen.
- 1 ml 2% SDS-Lösung und die Dynabeads mit einem Vortex. Kochen Sie während 5 Minuten.
- Sammeln Sie die Perlen und den Überstand entfernen. Dynabeads in 1 ml 0,2 M EDTA (pH = 7).
- Die Röhrchen in ein Ultraschallbad für 5 Minuten und einmal mehr wurde der Überstand entfernt.
- 1 ml Wasser zu und die Dynabeads die Perlen. Sammeln Sie die Perlen und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 1 ml 10 mM CoCl 2-Lösung. Legen Sie auf einem Schüttler für 10 Minuten.
- Entfernen Sie den Überstand mit Hilfe eines Magneten, um die Perlen zu sammeln und Resuspension in 1 ml Binding / Wash-Puffer.
- Entfernen Sie den Überstand und Waschen der Kügelchen zweimal mit 1 ml 20% (v / v) Ethanol
- Resuspendieren der Kügelchen in ihr ursprüngliches Volumen von 20% (v / v) ethanol regeneriert Kügelchen in einer Konzentration von 40 mg / ml zu erhalten.
6. Interpretation der Ergebnisse
- Probe 1, in dem keine radioaktiv markierten Virus zugegeben wird verwendet, um die Hintergrund-Radioaktivität zu beseitigen und die Radioaktivität 0% eingestellt werden. Control-Probe 2, die nicht enthält Nanobody und wo somit alle radioaktiv markierten Virus verbleibt im Überstand wird als 100% Radioaktivität Wert gesetzt.
- Der Anteil der Radioaktivität im Überstand (= a%) ist ein Maß für die gesamte Niederschlag (= 100 - a%) des radioaktiv markierten Virus durch den Nanobody.
7. Repräsentative Ergebnisse
Repräsentative Ergebnisse für dieses Affinitätsabfang-Assays sind in den 2, 3 und 4 gezeigt. In 2 wird die Affinität der PVSS38C ein Nanobody spezifisch für Poliovirus, gezeigt. Die Affinität der PVSS38C wurde für drei verschiedene Antigene getestet poliovIrus: Native-Antigen-(N-Antigen), Beheizt-Antigen (H-Antigen) und 14S-Untereinheiten. N-Antigen ist das intakte Virus, das ansteckend ist. Wenn das Virus wird erhitzt (20 Minuten bei 56 ° C) oder an einer festen Oberfläche (unveröffentlichte Ergebnisse), die Konformation der Kapsid ändert, was zu einer (teilweisen) Verlust der viralen RNA und dem Kapsidprotein VP4 und leer Kapside gebildet werden, die dann als H-Antigene. 14S-Untereinheiten sind Assemblierungsintermediate. Diese Antigene werden durch verschiedene Arten von Antikörpern nach der Immunisierung 10 erkannt und besitzen daher verschiedene Epitope und antigenen Bindungsstellen. In der Figur ist der Prozentsatz an Radioaktivität im Überstand wird in Abhängigkeit von der Konzentration des Nanobody dargestellt. Es ist ersichtlich, dass die Radioaktivität in dem Überstand der Proben mit radioaktiv markierten 14S-Untereinheiten mit steigenden Konzentrationen des Nanobody PVSS38C abnimmt. Dies kann als ein Anstieg in der Menge von Poliovirus 14S-Untereinheiten con übersetzt werdenangeschlossen an die Nanobody PVSS38C und indirekt an die magnetischen Beads. Die Erfassung Titer (= die Konzentration des Nanobody erforderlichen bis 50% des radioaktiv markierten Virus zu erfassen) kann graphisch als 0,099 nm berechnet werden. Nr. Affinität PVSS38C für die N-Antigens und H-antigene Form Poliovirus beobachtet wird. Aus diesen Daten wird so interpretiert, dass PVSS38C ist mit einem Epitop, das ausschließlich auf dem 14S-Untereinheit und nicht auf die beiden anderen antigenen Formen der Interaktion Poliovirus ist.
Um zu zeigen, dass der Verlust der Radioaktivität aus dem Überstand nur aufgrund der spezifischen Affinität des Nanobody gegenüber ihren Antigenen, gleich Assay wurde mit Nb1 durchgeführt, um ein Nanobody gegen die lrpB Transkriptionsregulator Sulfolobus sulfataricus erzeugt und bekannt sind keine Wechselwirkung mit einem Poliovirus-Antigen. Das Ergebnis dieser Analyse ist in 3 gezeigt. Alle radioaktiv markierten Virus bleibt in den Überständen der hervorgeht, dass es keine ReaktivitätNb1 gegen die drei antigenen Formen des Poliovirus.
Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse wurde durch Wiederholung des Experiments für insgesamt acht Mal für eine gegebene Nanobody (dh PVSP29F) an verschiedenen Tagen und von verschiedenen Personen getestet. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Der Mittelwert der Anteil Radioaktivität im Überstand wurde für jede Nanobody Konzentration berechnet und in Übereinstimmung mit der Standardabweichung dargestellt.
Abbildung 1. Eine Übersicht des Prinzips (A) und das Verfahren (B) des Assays. A. Nanokörper, die spezifisch eine bestimmte Poliovirus-Antigen in der Lage, mit den Kobalt-beschichteten magnetischen Kügelchen interagieren und wird so den radioaktiv markierten Virus His-Tag. B. His-markierten Nanokörper werden radioaktiv markierte Poliovirus hinzugefügt und inkubiert. Cobalt-beschichteten magnetischen Kügelchen sindzugegeben und magnetische Trennung des gebundenen / ungebundenem Antigen durchgeführt wird. Die Radioaktivität der Überstand wird gemessen und die Menge des eingefangenen Antigen abgeleitet werden kann.
Abbildung 2. Magnetic Beads Capture-Affinität von verschiedenen Poliovirus-Antigenen durch Nanobody PVSS38C. Der Anteil der Radioaktivität im Überstand gefunden wird als eine Funktion der Konzentration von PVSS38C dargestellt. Für eine Konzentration 14S-Wirkungs-Beziehung gefunden werden kann, zeigt das Zusammenspiel von PVSS38C mit einem Epitop vorhanden ausschließlich auf 14S. Keine signifikante Interaktion mit dem N-, oder H-Antigen kann erkannt werden, obwohl eine vernachlässigbare unspezifische Aufnahme in sehr hohen Konzentrationen festgestellt wird.
Abbildung 3. Magnetic Beads Capture-Affinität von verschiedenen Poliovirus-Antigenen durch Nanobody Nb1 in 2 ist daher nur durch die spezifische Affinität des Nanobody gegenüber ihren Antigenen.
Abbildung 4. Reproduzierbarkeit des Tests. Der Mittelwert der Anteil Radioaktivität im Überstand wird in Abhängigkeit von der Konzentration des Nanobody dargestellt. Das Experiment wurde achtmal an verschiedenen Tagen und von verschiedenen Personen wiederholt. Die Standardabweichung wird als vertikale Balken dargestellt.
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Discussion
In dem Protokoll wird die Radioaktivität des Antigens Interaktion mit dem Nanobody als Verlust von radioaktiv markiertem Virus aus dem Überstand definiert. Daher ist die Menge des ausgefällten Radioaktivität (= 100 - a%) (gebunden an die magnetischen Beads) in einer indirekten Weise durch die Radioaktivität im Überstand (= a%) geschätzt werden. Auf der anderen Seite ist es auch möglich, die Radioaktivität des gebundenen Fraktion ausgefallene von Antigen in direkter Weise durch Elution der Immunkomplexe von den magnetischen Beads mit 500 mM Imidazol zu messen. Es wurde zuvor 11 demonstriert, dass es eine perfekte Übereinstimmung zwischen der Gesamtmenge an Radioaktivität und die Summe der Radioaktivität im Überstand und Pellet-Fraktionen gefunden. Es ist daher akzeptabel und zeitsparende, um die Radioaktivität des Überstandes zu messen. Verfahren zur Elution der Immunkomplexe von den magnetischen Beads durch Thys et al., 2011 11.
Apart von Poliovirus, werden andere Picornaviren bekanntlich empfindlich auf festen Oberfläche induziert Konformationsänderung Umwandlung, wie die wirtschaftlich wichtigen Maul-und Klauenseuche-Virus (MKSV) 2. Die Veränderung der Form und der Verringerung der Bindungsaffinität von Proteinen im allgemeinen nach der Bindung an Kunststoff wird in der Literatur 12 beschrieben. Der Assay kann daher verwendet, um die Wechselwirkung mit anderen Proteinen, die empfindlich auf Konformationsänderungen zu erforschen, für die Epitopkartierung, um die Menge an korrekt gefaltete Proteine zu definieren, zu screenen Struktur Verunreinigungen während des Produktionsprozesses werden, für das schnelle Screening der Chargen während Produktion, kann zur Reinigung von Proben, die Mischungen von eng verwandten Proteinen und vielen anderen Anwendungen sind gedacht werden. Die Verfügbarkeit der verschiedenen magnetischen Kügelchen mit einer Affinität für verschiedene Tags unterstützt diese Möglichkeiten. Obwohl radioaktive Markierungen in diesen Experimenten verwendet wurden, könnten andere Signaleimplementiert zur Feststellung und Quantifizierung der Interaktionen, wie fluoreszierende Farbstoffe 13,14 werden. Viele Proben können während eines Experiment analysiert werden und es ist möglich, das Verfahren zu automatisieren. Die magnetischen Kügelchen in diesem Assay verwendet werden einfach durch eine siedende, Strippen und Regenerationsschritt, die dies macht ein kostengünstiges Verfahren wiederverwendet werden. Bis heute hat fünf dieser Regenerationszyklen der Perlen nicht die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse (Daten nicht gezeigt).
Darüber hinaus kann es als ein spezifisches Verfahren betrachtet werden, da bestimmte Nanokörper verwendet werden, die erkennen nur ihre Antigen, wie sie in der Lage anders mit der Poliovirus N-und H-Antigene und die 14S-Untereinheit wurden.
Es kann gefolgert werden, dass diese Affinitätsabfang-Assay unter Verwendung von magnetischen Kügelchen ein Assay mit einem breiten Bereich von möglichen Anwendungen, die zuverlässige, einfache, quantitative, spezifische, zeitsparende und kostengünstig ist ist.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitarbeitern der Abteilung für Pharmazeutische Biotechnologie und Molekularbiologie und insbesondere Monique de Pelsmacker für die Herstellung der radioaktiv markierten Virus. Wir bedanken uns bei Ellen Merckx und Hadewych Halewyck für ihre interessanten Ausführungen und Diskussionen und Gerrit de Bleeser für seine Hilfe im Labor. Diese Arbeit wurde finanziell durch eine OZR Gewährung der Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), dem Fonds voor Vlaanderen Wetenschappelijk Onderzoek (G.0168.10N) und der Weltgesundheitsorganisation (TSA 200410791) unterstützt. Lise Schotte ist ein Promotionsstipendium des Fonds voor Vlaanderen Wetenschappelijk Onderzoek (FWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ’HiSafe’ 2 | PerkinElmer, Inc. | 1200 - 436 | Scintillation fluid |
References
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