Summary

Aislamiento y cultivo de células neuronales de ratas embrionarias: un protocolo rápido

Published: May 24, 2012
doi:

Summary

Se describe un método rápido para aislar y cultivar las neuronas del hipocampo y la corteza a partir de embriones de roedores. Este protocolo nos permite realizar experimentos en los que los cultivos neuronales casi puros son necesarios.

Abstract

Estamos describiendo un método rápido para disociar y la cultura de las neuronas del hipocampo o la corteza a partir de embriones de rata E15-17. El procedimiento se puede aplicar con éxito para el aislamiento de ratón y humanos neuronas primarias y progenitores neurales. Neuronas disociadas se mantienen en medio libre de suero hasta varias semanas. Estos cultivos pueden ser utilizados para nucleofection, inmunocitoquímica, la preparación de ácidos nucleicos, así como la electrofisiología. Mayores cultivos neuronales también pueden ser transfectadas con una tasa de eficiencia bueno por transducción lentiviral y, menos eficiente, con fosfato de calcio o basados ​​en lípidos métodos tales como lipofectamina.

Protocol

1. Poly-D-lisina (PDL): Preparación Añadir 5 ml de ddH estéril 2 O a 5 mg de PDL para obtener una solución madre de 1 mg / ml. Mezcle la solución stock de pipetear varias veces. Usar inmediatamente o almacenar poli-D-lisina solución a 2-8 ° C. 2. Poly-D-lisina (PDL): revestimiento de plástico placas de cultivo de células Diluir la solución madre de PDL con estéril O ddH 2 a la concentración final de 10 g / ml. …

Discussion

El método de disección y cultivo de las neuronas del hipocampo de rata y cortical aquí descrito permite la realización de experimentos utilizando cultivos neuronales casi puros cultivadas en un medio químicamente definido (Figura 3). Aunque los protocolos para el cultivo de las neuronas casi puros en medios libres de suero han sido descritas previamente 2,3,4, hay cambios importantes realizados en nuestro método. A diferencia de los protocolos tradicionales (es decir, Banker et al.) <su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a Jonna Ellis por su asistencia editorial. El proyecto descrito fue apoyada por el premio número R01MH079751 (IP: F. Peruzzi) del Instituto Nacional de Salud Mental. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud Mental o los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Reagent Concentration
Neurobasal 98%
B27 2%
Glutamax 0.5 mM

Table I. Neurobasal/B27 complete medium.

Reagent Concentration
Glucose 16 mM
Sucrose 22 mM
HEPES 10 mM
NaCl 160 mM
KCl 5 mM
Na2HPO4 1 mM
KH2PO2 0.22 mM
Gentamicin 50 μg/ml
Fungizone 250 ng/ml
pH 7.4
Osmolarity 320-330 mOsm

Table II. Dissection medium.

Reagent Volume (μl)
Neurobasal/B27 complete medium 240
Trypan Blue Stain 0.4% 250
Total 490

Table III. 50x Counting solution.

Reagent Company Cat. number
Hibernate E Brainbits 767171
Neurobasal Gibco, Invitrogen 21103-049
B27 Gibco, Invitrogen 17504-044
Fungizone Gibco, Invitrogen 15290-018
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G1264
Glutamax 200 mM Gibco, Invitrogen 35050
TrypLE Express w/o phenol red Gibco, Invitrogen 12604
Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride Sigma Aldrich C6645
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich P6407
Laminin 1 mg/ml Millipore CC095
HEPES Sigma Aldrich H3375
Trypan Blue Stain 0.4% Gibco, Invitrogen 15250

Table IV. Specific reagents.

Equipment Company Cat. number
Stereo Microscope Olympus SZ61
Large Forceps FST 11022-14
Fine-tipped forceps Moria MC40B
Micro fine-tipped forceps Moria MC31
Razor-sharp scissors Roboz RS-6820
Micro Dissecting scissors FST 91460-11
Micro Dissecting Curved scissors FST 14067-11
Glass 2-chamber slides Lab-Tek 154461
60 mm dishes BD Falcon 353002
100 mm dishes Corning 430167
15 ml tubes BD Falcon 352099
1.5 ml cryo-tube vial Nunc 375353

Table V. Specific equipment.

References

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  4. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
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Cite This Article
Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol. J. Vis. Exp. (63), e3965, doi:10.3791/3965 (2012).

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