Summary

Isolement et culture de cellules embryonnaires de rat neurones: un protocole rapide

Published: May 24, 2012
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode rapide d'isoler et de la culture neurones de l'hippocampe et du cortex à partir d'embryons de rongeurs. Ce protocole nous permet d'effectuer des expériences dans lesquelles presque purs des cultures de neurones sont nécessaires.

Abstract

Nous décrivons une méthode rapide de dissocier et de la culture neurones de l'hippocampe ou corticale à partir d'embryons de rat E15-17. La procédure peut être appliquée avec succès à l'isolement de la souris et l'homme neurones primaires et les progéniteurs neuronaux. Neurones dissociés sont maintenues dans un milieu sans sérum jusqu'à plusieurs semaines. Ces cultures peuvent être utilisés pour nucléofection, immunocytochimie, la préparation des acides nucléiques, ainsi que l'électrophysiologie. Les seniors cultures neuronales peuvent également être transfectées avec un taux d'efficacité de bon par transduction lentivirale et, de manière moins efficace, avec le phosphate de calcium ou à base de lipides des méthodes telles que la lipofectamine.

Protocol

1. Poly-D-Lysine (PDL): Préparation Ajouter 5 ml de solution stérile ddH 2 O à 5 mg de PDL pour obtenir une solution stock de 1 mg / ml. Mélanger la solution stock de pipetage à plusieurs reprises. Utiliser immédiatement ou conserver Poly-D-Lysine solution à 2-8 ° C. 2. Poly-D-Lysine (PDL): revêtement en plastique Vaisselle Culture Cellulaire Diluer la solution mère PDL stérile O ddH 2 à la concentration finale…

Discussion

La méthode de la dissection et la culture de neurones d'hippocampe de rat et corticale décrite ici permet d'effectuer des expériences en utilisant presque purs des cultures de neurones cultivés dans un milieu chimiquement défini (Figure 3). Bien que les protocoles pour les neurones en culture presque purs dans des milieux sans sérum ont été décrits précédemment 2,3,4, il ya des changements importants réalisés dans notre méthode. Différent de protocoles traditionnels (c….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Jonna Ellis pour son assistance éditoriale. Le projet décrit a été soutenue par R01MH079751 Nombre Prix (PI: F. Peruzzi) de l'Institut national de la santé mentale. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national de santé mentale ou de la National Institutes of Health.

Materials

Reagent Concentration
Neurobasal 98%
B27 2%
Glutamax 0.5 mM

Table I. Neurobasal/B27 complete medium.

Reagent Concentration
Glucose 16 mM
Sucrose 22 mM
HEPES 10 mM
NaCl 160 mM
KCl 5 mM
Na2HPO4 1 mM
KH2PO2 0.22 mM
Gentamicin 50 μg/ml
Fungizone 250 ng/ml
pH 7.4
Osmolarity 320-330 mOsm

Table II. Dissection medium.

Reagent Volume (μl)
Neurobasal/B27 complete medium 240
Trypan Blue Stain 0.4% 250
Total 490

Table III. 50x Counting solution.

Reagent Company Cat. number
Hibernate E Brainbits 767171
Neurobasal Gibco, Invitrogen 21103-049
B27 Gibco, Invitrogen 17504-044
Fungizone Gibco, Invitrogen 15290-018
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G1264
Glutamax 200 mM Gibco, Invitrogen 35050
TrypLE Express w/o phenol red Gibco, Invitrogen 12604
Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride Sigma Aldrich C6645
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich P6407
Laminin 1 mg/ml Millipore CC095
HEPES Sigma Aldrich H3375
Trypan Blue Stain 0.4% Gibco, Invitrogen 15250

Table IV. Specific reagents.

Equipment Company Cat. number
Stereo Microscope Olympus SZ61
Large Forceps FST 11022-14
Fine-tipped forceps Moria MC40B
Micro fine-tipped forceps Moria MC31
Razor-sharp scissors Roboz RS-6820
Micro Dissecting scissors FST 91460-11
Micro Dissecting Curved scissors FST 14067-11
Glass 2-chamber slides Lab-Tek 154461
60 mm dishes BD Falcon 353002
100 mm dishes Corning 430167
15 ml tubes BD Falcon 352099
1.5 ml cryo-tube vial Nunc 375353

Table V. Specific equipment.

References

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  10. Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).

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Cite This Article
Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol. J. Vis. Exp. (63), e3965, doi:10.3791/3965 (2012).

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