Summary
Vi beskriver en snabb metod för att isolera och kultur hippocampus och kortikala neuroner från gnagare embryon. Detta protokoll ger oss möjlighet att utföra experiment i vilka nästan rena neuronala kulturer krävs.
Abstract
Vi beskriver en snabb metod att separera och kultur hippocampus eller kortikal neuroner från E15-17 råttembryon. Förfarandet kan tillämpas med framgång för isolering av mus-och humana primära neuroner och neurala progenitorceller. Dissocierade neuroner bibehålls i serumfritt medium upp till flera veckor. Dessa kulturer kan användas för nucleofection, immunocytokemi, nuklein-syror beredning, liksom elektrofysiologi. Äldre neuronala kulturer kan också transfekteras med en god verkningsgrad genom att lentivirala transduktion och, mindre effektivt, med kalciumfosfat eller lipid-baserade metoder, såsom lipofektamin.
Protocol
1. Poly-D-lysin (PDL): Framställning
- Tillsätt 5 ml steril ddHaO 2 O till 5 mg av PDL att erhålla en förrådslösning av 1 mg / ml.
- Blanda stamlösning genom att pipettera flera gånger.
- Använd omedelbart eller förvara Poly-D-Lysin lösning vid 2-8 ° C.
2. Poly-D-lysin (PDL): Beläggning av plast cellodlingsskålar
- Späd PDL stamlösning med sterilt ddHaO 2 O för att den slutliga koncentrationen av 10 ^ g / ml.
- Pipetten tillräckligt lösningen i en 60 mm skål för att täcka området kultur yta (3 ml för en 60 mm skål).
- Gunga försiktigt för att säkerställa jämn beläggning av kulturen yta.
- Inkubera plattorna vid rumstemperatur (RT) över natten.
- Nästa dag, vanligtvis dagen för dissektion, ta bort Poly-D-Lysin lösning genom aspiration och tvätta kort med 3 ml sterilt ddHaO 2 O. Upprepa detta steg. Efter den andra tvättningen avlägsnar vatten fullständigt genom aspiration.
- Plattorna kan lagras vid 4 ° C under upp till tre veckor.
3. Poly-D-lysin (PDL) och laminin: Framställning och beläggning av glas med två kammare Objektglas
- Blandning PDL (1 mg / ml) och laminin (1 mg / ml) förrådslösningar i sterilt ddHaO 2 O till en slutlig koncentration av 10 och 5 ^ g / ml.
- Pipetten tillräckligt lösning i brunnar i en glas med två kammare glider för att täcka området kultur ytan (1 ml för varje brunn i en 2 brunn glas med två kammare sida).
- Gunga försiktigt för att säkerställa jämn beläggning av kulturen yta.
- Inkubera plattorna vid RT över natten.
- Nästa dag, ta bort Poly-D-Lysin-Laminin beläggningslösning via aspiration och tvätta kort två gånger med 1 ml steril ddHaO 2 O. Efter den andra tvättningen avlägsnar vatten fullständigt genom aspiration.
- Chamber bilder kan lagras vid 4 ° C i upp till tre veckor.
Obs: kan någon glaskammare objektglas beläggas following. detta protokoll. Vi använder ofta två kammare bilder eftersom varje bild ger kontroll-test experimentell inställning (t.ex. obehandlat kontra behandlas otransfekterade kontra transfekterade).
4. Neuronal Dissection och kultur
- Värma följande reagens i ett 37 ° C vattenbad:
- TrypLE Express på sin ursprungliga 100 ml flaska.
- Neurobasal/B27 komplett medium (se tabell I). Volymen värmde beror på antalet rätter är pläterad (t.ex. 30 ml för tio 60 mm guldpläterade rätter).
- Tillsätt 3 ml kall viloläge E lösningen till fyra 60 mm odlingsskålar och 13 ml av en 15 ml BD Falcon hög klarhet polypropen koniskt rör.
- Tillsätt 25-30 ml kall dissektion medium (se tabell II, Dr Olimpia meucci, personlig kommunikation) för att var och en av tre 100 mm odlingsskålar. Dessa plattor, innehållande en stor volym av medium, kommer att användas för att tvätta de embryon omedelbart efter derasavlägsnande från amniotiska säckar (steg 4.7 och 4.8).
- Euthanize en E17 tidsinställd dräktiga råttor av CO 2 i enlighet med Public Health Services Policy för mänsklig omsorg och användning av försöksdjur och under ett institutionellt godkänd djuromsorg och använda protokoll.
- Spraya nedre delen av buken med 70% EtOH och skär medialt genom huden och musklerna med en sax exponerar livmodern och embryon.
- Ta bort alla foster och placera dem i en steril 100-mm skål innehållande ett överskott av kall dissekering medelhög (25-30 ml, se steg 4,3).
- Skär embryon med en liten sax från fostersäcken och placera dem i den andra 100-mm skål innehållande kallt dissektion medium.
- Tvätta de embryon vid rumstemperatur genom att sakta vända 100-mm skål under 5-10 sekunder. Sedan överför de sköljda embryona till den tredje 100 mm skål som innehåller dissekera medium. Två tvättar utöver mediet är vanligtvis tillräckligt för att avlägsna alla spår av blod. Om emellertid ej tidigare nämndadiga, tvätta en gång med en ny 100-mm skål innehållande 25-30 ml kallt dissekering medium.
- Med ett stereomikroskop och böjda pincett, extrahera varje råtta embryo hjärna genom att dra ut huden och skalle. Placera hela hjärnan i en av de 60-mm skålar (vanligen med högst 5 hjärnor per skål) med kallt Hibernate E. Håll dessa plattor på is.
- Ta en rätt åt gången, och under ett dissektionsmikroskop, separera halvkloten och isolera hjärnbarken bort mellanhjärnan och hjärnhinnorna.
- Tillval: Klipp hjärnor längs mittlinjen, extrahera hippocampi och följ anvisningarna nedan för att isolera hippocampus nervceller.
- Samla in alla de dissekerade cortices i en 15-ml klar koniskt rör innehållande 13 ml kall viloläge E. Lämna hjärnbarken på is till dess alla dissektioner är klara. På grund av sin ringa storlek kan dissekeras hippocampi samlas i en 1,5-ml Eppendorf-rör istället för en 15-ml rör. Om så önskas, i detta steg cortex ellerHippocampi kan placeras i en cryotube ampull innehållande 1 ml viloläge E + 2% B27 + gentamicin (50 pg / ml) + Fungizone (250 ng / ml) i proportionen av 2-4 cortex eller 2-4 hippocampi per flaska. Hjärnvävnad kan lagras vid 4 ° C i mörker under upp till en vecka (senare tider har inte testas än). Vid behov kan du använda fina pincett för att överföra hjärnvävnaden till ett 15 ml rör innehållande Hibernate E och sedan följa protokollet nedan för att isolera nervceller.
- Överföra röret till en vävnadsodlingsplatta med huven. Tillåta cortex att sedimentera till botten av röret och därefter försiktigt avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 13 ml färskt viloläge E till 15-ml koniskt rör, tillåter cortex sedimentera på botten av röret och noggrant avlägsna supernatanten. Upprepa detta steg ytterligare 2 gånger och efter den sista tvätten, försiktigt bort alla medier.
- Enzymatiskt smälta hjärnbarken genom att lägga till 1-2 ml (beroende på antalet cortex, använd mindre för hippocampi isolering) av varma TrypLE Express. Försegla locket på röret med Parafilm och flyta i röret i en 37 ° C vattenbad under 10 minuter.
- Spruta röret med 70% etanol före öppning av locket och tillsätt 10 ml viloläge E. Låt cortex att sedimentera på botten av röret och avlägsna supernatanten. Upprepa detta steg tre gånger för att tvätta bort TrypLE Express. I sista steget, försiktigt bort alla medier.
- Försiktigt triturera (4-5 gånger) av cortex i 2 ml Neurobasal/B27 komplett medium med användning av en flampolerad Pasteur-glas (ungefär 1 mm i diameter). Var noga med att undvika bubblor.
- Upprepa ytterligare 4-5 gånger med en steril Pasteurpipett av glas mindre i diameter (dvs. en pipett ca 1/2-3/4 mm i diameter). Använd inte en Pasteur-pipett mindre än detta eller kommer det att förstöra cellerna.
- Låt resterande bitar av vävnad (i allmänhet mycket få, om några) för att lösa.
- Överföra det övre enkelcellsuspension till en ny 15-ml rör och lämnar efter sig lösas bitar av vävnad. Furterligare späda cellsuspensionen upp till 10-12 ml med Neurobasal/B27 komplett medium.
- Blanda väl och späd-celler för räkning genom tillsats av 10 pl av cellsuspensionen till 490 | il av 50x Räkning lösning (se tabell III) i ett 1,5 ml Eppendorf-rör.
- Plattan celler på PDL-belagda plattor vid en densitet av 5,0 x 10 4 / cm 2. Om nucleofection skall utföras, rekommenderar vi utstrykning av cellerna på en högre koncentration (8-10 x 10 4 / cm 2).
- Normalt dissekera vi 9-10 foster per försök, eftersom cirka 13 x 10 6 nervceller härrör från varje E17 fostret. Om fler embryon behövs, se till att hela förfarandet inte längre än två timmar.
- Om så önskas, 24 timmar efter isolering, kan 10 | iM av cytosin-β-D-arabinofuranosid (AraC) sättas till varje skål, för att förhindra gliaproliferation. Dock detta steg inte krävs eftersom Neurobasal/B27 medelstora hämmar gliaproliferation, Enligt tillverkarens rekommendationer (Invitrogen / Gibco).
- Nervceller kan användas för försök efter 4-5 dagar in vitro, men exakt tid beror på önskad differentiering scenen. Vi har odlade neuroner i upp till 4 veckor utan en signifikant minskning i överlevnad (Fig. 1).
- För utökad odling, byt odlingsmediet varje vecka med nygjord Neurobasal/B27 komplett medium.
5. Representativa resultat
Neuroner odlade på objektglas glaskammare kan utsättas för immunocytokemi. Figur 1 visar en typisk bild av en kortikal neuroner fixerad efter fem dagar i odling och immunolabeled med anti-MAP-2-antikropp för att visa neuronala processer.
Figur 2 visar en representativ bild av en råtta hippocampus neuron efter 3 veckor i odling. Den neuronal morfologi i en fullständigt differentierad cell är markerad med MAP-2 immunolabeling (MAP-2 neuronala markör, mus-monoklonal antikropp klon AP-20, Gene Tex, Irvine, CA), enligt en standardprocedur som tidigare beskrivits 1. Bilderna visualiserades med Nikon Eclipse E400 upprätt fluorescensmikroskop utrustat med EXI aqua kamera (Qimaging), motoriserad Z-axeln och SlideBook5 förvärv / avfaltning programvara (Intelligent Imaging Innovations, Inc., Denver, CO). En serie av tredimensionella bilder av varje individuell bild togs deconvoluted till en tvådimensionell bild och lösas genom justering av signalen avskärning till nästan maximal intensitet för att öka upplösningen.
Figur 3 visar renheten hos neuronala kulturer. Proteinlysat erhölls från DIV7 råtta neuronala kulturer (Ctx) och från ett fall av humant glioblastom (GBM). Som förväntat är den neuronala lysatet starkt positiva för den neuronala proteiner MAP-2 och negativ för astrocytisk markör GFAP, medan GBM-proteinet lysatet är negativ feller MAP-2 och positivt för GFAP.
Även i vår protokollet har vi använt Hibernate E under flera år som dissekera och sköljning medium, vi nyligen har utforskat en ytterligare och mycket praktisk användning av IT för att bevara hjärnans vävnader för vidare användning. Illustrerar en dag in vitro 5 (DIV5) Figur 4 kultur av råtta kortikala neuroner som isolerats från cortex som hålls vid 4 ° C under en vecka i viloläge E + B27 efter deras ursprungliga dissektion från embryon. Neuroner ströks ut på en glas med två kammare objektglas belagt med PDL och laminin som tidigare beskrivits. Den förvärvade bilden deconvoluted med SlideBook5 förvärv / avfaltning programvara som beskrivits ovan (figur 2).
Figur 1. Representativ bild av en kortikal neuroner nucleofected med pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) och immunolabeled med MAP-2 Antikropp, i rött. Original förstoring 100x.
Figur 2. Representativ bild visar MAP-2 immunomärkning, i rött av hippocampus neuroner efter 3 veckor i odling. DAPI färgning, i blått, visar cellulär kärnor. Ursprunglig förstoring 40x.
Figur 3. Western blöt visande renhet av neuronala cellkulturer. 30 pg av rått-neuronala och humant lysat GBM protein separerades med elektrofores och utsattes för Western blot-analys enligt standardförfaranden 1. Anti-MAP-2 var en polyklonal kanin från Cell Signaling (Danvers, MA), var anti-GFAP-antikropp en monoklonal mus från Chemicon (Millipore, Billerica, MA), och mus-monoklonal anti-Grb2-antikropp var från BD Transduction Laboratories ( Sparks, MD). GRB2 användes som en laddningskontroll. 
Figur 4. Representativa bilder av dagar in vitro 5 (DIV5) från råtta kortikala neuroner som erhållits från cortex kvar i viloläge E + B27 vid 4 ° C under en vecka efter deras dissektion. A) Faskontrast av neuroner odlade på ett glas med två kammare objektglas. Ursprunglig förstoring 20X. B) Immunofluorescens visar uttryck av MAP-2 i neuronala processer i grönt, den kulturen var negativ för astrocytisk markören GFAP. DAPI färgning, i blått, indikerar cellulär kärnor. Ursprunglig förstoring 40x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden enligt dissektion och odling av rått-hippocampus och kortikala neuroner som beskrivs här medger att utföra experiment med användning nästan rena neuronala kulturer som odlats i ett kemiskt definierat medium (figur 3). Även protokoll för odling av nästan rena nervceller i serum-fria medier har tidigare beskrivits 2,3,4, det finns viktiga ändringar som görs i vår metod. Skiljer sig från traditionella protokoll (dvs. Banker et al.) 5 har vi ersatt trypsin med TrypLE Express, ett skonsammare dissociation enzym. Vi har också utelämnat två steg som potentiellt påverkar integriteten hos neuronala celler: mals cortex eller hippocampus före enzymatisk nedbrytning och använda DNas. Dessutom hjälpte dissektion av embryon i Hibernate E (steg 4,2) för att bevara livskraftiga och friska celler. Hibernate E är ett näringsmedium som används för underhåll av neurala vävnader eller celler i omgivande nivåer av koldioxid (Invitrogen, Life Technologies, Grand Isloch, NY). Ursprungligen formulerade för transport isolerade hjärnregioner (hippocampus, striatum och cortex), kan viloläge E-medium användas för att hålla hjärnan livskraftiga under isolering av nervvävnad eller för att hålla neuroner friska under mikroskop, elektrofysiologi eller flödescytometri. I själva verket visar figur 4 en representativ bild av råtta kortikala neuroner odlades under 5 dagar på glas två kammare objektglas. Före deras bearbetning, har cortex hölls vid 4 ° C i viloläge E + B27 i mörker under en vecka efter deras dissektion från E17-embryon. Intressant nog var neuroner som isolerats från vävnad som hölls vid 4 ° C under några dagar morfologiskt jämförbara med dem som isolerades på samma dagar som embryot dissektion. Har valet att isolera neuroner vid olika tidpunkter efter dissektion av embryona kan vara till stor hjälp när man planerar experiment och, därför, i vilket en fullständig användning av tid-gravida djur.
Det bör mentioned att vår protokollet fungerar effektivt på embryon från E13 till E17, men det har aldrig testats för nyfödda och vuxna gnagare. Det fungerade också mycket bra för isolering och odling av humana fetala nervceller (opublicerade data).
Celler som isolerats med förfarandet som beskrivs här kan pläteras i vävnadskulturskålar under experiment som kräver upptagning av ett stort antal celler för RNA / DNA eller protein extraktion. Exempel innefattar behandling av nervceller med vissa föreningar eller peptider, såsom i vårt arbete med HIV-Tat-protein 1. Tillväxtfaktor-medierade signalvägar kan också undersökas eller RNA kan renas för genexpression eller miRNA matriser profilering 6.
Dessutom tillhandahåller nucleofection av neuronerna före plätering ett verktyg för att undersöka molekyler eller tillväxtbetingelser som påverkar neuronal differentiering 1. Andra användningsområden inkluderar transfektion av differentierade neuroner genom lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 1. Medan effektiviteten för transfektion är ganska låg jämfört med nucleofection, är den lämplig för mycket känsliga analyser såsom luciferasrapporterareanalys eller elektrofysiologiska studier. Dessutom kan neuroner odlade på glaset kammarobjektglas underkastas immunocytokemi (figurerna 1 och 4B) 1. Slutligen följde vi framgångsrikt detta protokoll att skilja neurala stamceller från musembryon 7, med en ändring i sista steget i vilket isolerade neurala stamceller odlas i ett definierat medium som tidigare beskrivits 7,8. Sammantaget har denna enkla metod en mängd olika applikationer och lätt ger neuroner för studier som inte kräver glia att stödja neuronala kulturer. Emellertid kan glial co-kultur eller gliahärledd konditionerat medium läggas till dessa neuronala kulturer för att undersöka mekanismerna för synaps bildning inducerade av gliaceller 9, såsom studier beskrivs av Pfrieger och Barres 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Jonna Ellis för redaktionellt hjälp. Projektet beskrivs stöds av Award Antal R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) från National Institute of Mental Health. Innehållet är endast ansvar författarnas egna och inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter National Institute of Mental Health och National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal | 98% | ||
| B27 | 2% | ||
| Glutamax | 0.5 mM | ||
| Table I. Neurobasal/B27 complete medium. | |||
| Glucose | 16 mM | ||
| Sucrose | 22 mM | ||
| HEPES | 10 mM | ||
| NaCl | 160 mM | ||
| KCl | 5 mM | ||
| Na2HPO4 | 1 mM | ||
| KH2PO2 | 0.22 mM | ||
| Gentamicin | 50 μg/ml | ||
| Fungizone | 250 ng/ml | ||
| pH | 7.4 | ||
| Osmolarity | 320-330 mOsm | ||
| Table II. Dissection medium. | |||
| Neurobasal/B27 complete medium | 240 | ||
| Trypan Blue Stain 0.4% | 250 | ||
| Total | 490 | ||
| Table III. 50x Counting solution. | |||
| Hibernate E | Brainbits | 767171 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Fungizone | GIBCO, by Life Technologies | 15290-018 | |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1264 | |
| Glutamax 200 mM | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| TrypLE Express w/o phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 12604 | |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Laminin 1 mg/ml | EMD Millipore | CC095 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250 | |
| Table IV. Specific reagents. | |||
| Stereo Microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Large Forceps | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Fine-tipped forceps | Moria | MC40B | |
| Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 | |
| Razor-sharp scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6820 | |
| Micro Dissecting scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Micro Dissecting Curved scissors | Fine Science Tools | 14067-11 | |
| Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 | |
| 60 mm dishes | BD Biosciences | 353002 | |
| 100 mm dishes | Corning | 430167 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| 1.5 ml cryo-tube vial | Nalge Nunc international | 375353 | |
| Table V. Specific equipment. | |||
References
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons. Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , The MIT Press. Cambridge. (1998).
- Eletto, D. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a. J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).
- Gualco, E. IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors. Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
- Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).
