Vi beskriver en snabb metod för att isolera och kultur hippocampus och kortikala neuroner från gnagare embryon. Detta protokoll ger oss möjlighet att utföra experiment i vilka nästan rena neuronala kulturer krävs.
Vi beskriver en snabb metod att separera och kultur hippocampus eller kortikal neuroner från E15-17 råttembryon. Förfarandet kan tillämpas med framgång för isolering av mus-och humana primära neuroner och neurala progenitorceller. Dissocierade neuroner bibehålls i serumfritt medium upp till flera veckor. Dessa kulturer kan användas för nucleofection, immunocytokemi, nuklein-syror beredning, liksom elektrofysiologi. Äldre neuronala kulturer kan också transfekteras med en god verkningsgrad genom att lentivirala transduktion och, mindre effektivt, med kalciumfosfat eller lipid-baserade metoder, såsom lipofektamin.
Metoden enligt dissektion och odling av rått-hippocampus och kortikala neuroner som beskrivs här medger att utföra experiment med användning nästan rena neuronala kulturer som odlats i ett kemiskt definierat medium (figur 3). Även protokoll för odling av nästan rena nervceller i serum-fria medier har tidigare beskrivits 2,3,4, det finns viktiga ändringar som görs i vår metod. Skiljer sig från traditionella protokoll (dvs. Banker et al.) 5 har vi ersatt trypsin med TrypL…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Jonna Ellis för redaktionellt hjälp. Projektet beskrivs stöds av Award Antal R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) från National Institute of Mental Health. Innehållet är endast ansvar författarnas egna och inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter National Institute of Mental Health och National Institutes of Health.
Reagent | Concentration |
Neurobasal | 98% |
B27 | 2% |
Glutamax | 0.5 mM |
Table I. Neurobasal/B27 complete medium.
Reagent | Concentration |
Glucose | 16 mM |
Sucrose | 22 mM |
HEPES | 10 mM |
NaCl | 160 mM |
KCl | 5 mM |
Na2HPO4 | 1 mM |
KH2PO2 | 0.22 mM |
Gentamicin | 50 μg/ml |
Fungizone | 250 ng/ml |
pH | 7.4 |
Osmolarity | 320-330 mOsm |
Table II. Dissection medium.
Reagent | Volume (μl) |
Neurobasal/B27 complete medium | 240 |
Trypan Blue Stain 0.4% | 250 |
Total | 490 |
Table III. 50x Counting solution.
Reagent | Company | Cat. number |
Hibernate E | Brainbits | 767171 |
Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G1264 |
Glutamax 200 mM | Gibco, Invitrogen | 35050 |
TrypLE Express w/o phenol red | Gibco, Invitrogen | 12604 |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 |
Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 |
Laminin 1 mg/ml | Millipore | CC095 |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
Table IV. Specific reagents.
Equipment | Company | Cat. number |
Stereo Microscope | Olympus | SZ61 |
Large Forceps | FST | 11022-14 |
Fine-tipped forceps | Moria | MC40B |
Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 |
Razor-sharp scissors | Roboz | RS-6820 |
Micro Dissecting scissors | FST | 91460-11 |
Micro Dissecting Curved scissors | FST | 14067-11 |
Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 |
60 mm dishes | BD Falcon | 353002 |
100 mm dishes | Corning | 430167 |
15 ml tubes | BD Falcon | 352099 |
1.5 ml cryo-tube vial | Nunc | 375353 |
Table V. Specific equipment.