وصفنا منهجية السريع لعزل والثقافة الخلايا العصبية قرن آمون والقشرة من أجنة القوارض. هذا البروتوكول يسمح لنا لإجراء تجارب التي يلزم فيها الثقافات العصبية نقي تقريبا.
نحن تصف طريقة سريعة لفصل الخلايا العصبية قرن آمون والثقافة أو من أجنة الفئران القشرية E15-17. ويمكن تطبيق هذا الإجراء بنجاح إلى العزلة من الفأر والخلايا العصبية الأولية الإنسان والأسلاف العصبية. تتم المحافظة على الخلايا العصبية في فصل المصل خالية المتوسطة تصل إلى عدة أسابيع. ويمكن استخدام هذه الثقافات لnucleofection، كيمياء سيتولوجية مناعية، الأحماض النووية الإعداد، وكذلك الكهربية. ويمكن أيضا أن أقدم الثقافات العصبية يمكن transfected مع معدل كفاءة جيدة من خلال تنبيغ lentiviral، وأقل كفاءة، مع فوسفات الكالسيوم أو للدهون، على أساس أساليب مثل lipofectamine.
ووصف طريقة تشريح وثقافة من الخلايا العصبية الفئران قرن آمون والقشرة هنا يتيح إجراء التجارب باستخدام الخلايا العصبية الثقافات نقي تقريبا نمت في المتوسط محددة الصفات كيميائيا (الشكل 3). وعلى الرغم من بروتوكولات لزراعة الخلايا العصبية في مصل الدم النقي تقر…
The authors have nothing to disclose.
نشكر يونا اليس للحصول على مساعدة التحرير. وأيد المشروع التي وصفها عدد جائزة R01MH079751 (PI: F. بيروتزي) من المعهد الوطني للصحة العقلية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للصحة العقلية أو المعاهد الوطنية للصحة.
Reagent | Concentration |
Neurobasal | 98% |
B27 | 2% |
Glutamax | 0.5 mM |
Table I. Neurobasal/B27 complete medium.
Reagent | Concentration |
Glucose | 16 mM |
Sucrose | 22 mM |
HEPES | 10 mM |
NaCl | 160 mM |
KCl | 5 mM |
Na2HPO4 | 1 mM |
KH2PO2 | 0.22 mM |
Gentamicin | 50 μg/ml |
Fungizone | 250 ng/ml |
pH | 7.4 |
Osmolarity | 320-330 mOsm |
Table II. Dissection medium.
Reagent | Volume (μl) |
Neurobasal/B27 complete medium | 240 |
Trypan Blue Stain 0.4% | 250 |
Total | 490 |
Table III. 50x Counting solution.
Reagent | Company | Cat. number |
Hibernate E | Brainbits | 767171 |
Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G1264 |
Glutamax 200 mM | Gibco, Invitrogen | 35050 |
TrypLE Express w/o phenol red | Gibco, Invitrogen | 12604 |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 |
Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 |
Laminin 1 mg/ml | Millipore | CC095 |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
Table IV. Specific reagents.
Equipment | Company | Cat. number |
Stereo Microscope | Olympus | SZ61 |
Large Forceps | FST | 11022-14 |
Fine-tipped forceps | Moria | MC40B |
Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 |
Razor-sharp scissors | Roboz | RS-6820 |
Micro Dissecting scissors | FST | 91460-11 |
Micro Dissecting Curved scissors | FST | 14067-11 |
Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 |
60 mm dishes | BD Falcon | 353002 |
100 mm dishes | Corning | 430167 |
15 ml tubes | BD Falcon | 352099 |
1.5 ml cryo-tube vial | Nunc | 375353 |
Table V. Specific equipment.