Summary

Isolamento e cultivo de células neurais embrionárias de ratos: um protocolo rápido

Published: May 24, 2012
doi:

Summary

Nós descrevemos uma metodologia rápida para isolar e cultivar os neurônios do hipocampo e cortical a partir de embriões de roedores. Este protocolo permite a realização de experimentos em que quase puras culturas neuronais são necessários.

Abstract

Estamos descrevendo um método rápido para dissociar cultura e os neurônios do hipocampo ou cortical a partir de embriões de ratos E15-17. O procedimento pode ser aplicado com sucesso para o isolamento de rato e humanos neurónios primários e progenitores neurais. Neurónios dissociadas são mantidas em meio isento de soro até várias semanas. Estas culturas podem ser utilizados para nucleofection, imunocitoquímica, a preparação de ácidos nucleicos, bem como electrofisiologia. Mais velhos culturas neuronais também podem ser transfectadas com uma taxa de uma boa eficiência de transdução por lentivirus e, de forma menos eficiente, com fosfato de cálcio ou de lípidos métodos baseados em tais como lipofectamina.

Protocol

1. Poli-D-lisina (PDL): Preparação Adicionar 5 ml de ddH2O estéril a 5 mg de PDL para se obter uma solução stock de 1 mg / ml. Misture solução estoque pipetando várias vezes. Use imediatamente ou guarde Poly-D-lisina solução a 2-8 ° C. 2. Poli-D-lisina (PDL): Revestimento de plástico pratos de cultura de células Dilui-se a solução de reserva com PDL estéril ddH2O para a concentração final de 10 ug / ml. <…

Discussion

O método de dissecção e cultura de neurónios do hipocampo de ratos e cortical aqui descrito permite a realização de experiências usando quase puros culturas neuronais cultivadas num meio quimicamente definido (Figura 3). Embora os protocolos para os neurónios de cultura quase puros em meios isentos de soro foram anteriormente descritos 2,3,4, há alterações importantes feitas em nosso método. Diferente de protocolos tradicionais (isto é, Banker et al.) 5, temos substitu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Jonna Ellis para a assistência editorial. O projeto descrito foi apoiada por número Prêmio R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) do Instituto Nacional de Saúde Mental. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Saúde Mental ou o National Institutes of Health.

Materials

Reagent Concentration
Neurobasal 98%
B27 2%
Glutamax 0.5 mM

Table I. Neurobasal/B27 complete medium.

Reagent Concentration
Glucose 16 mM
Sucrose 22 mM
HEPES 10 mM
NaCl 160 mM
KCl 5 mM
Na2HPO4 1 mM
KH2PO2 0.22 mM
Gentamicin 50 μg/ml
Fungizone 250 ng/ml
pH 7.4
Osmolarity 320-330 mOsm

Table II. Dissection medium.

Reagent Volume (μl)
Neurobasal/B27 complete medium 240
Trypan Blue Stain 0.4% 250
Total 490

Table III. 50x Counting solution.

Reagent Company Cat. number
Hibernate E Brainbits 767171
Neurobasal Gibco, Invitrogen 21103-049
B27 Gibco, Invitrogen 17504-044
Fungizone Gibco, Invitrogen 15290-018
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G1264
Glutamax 200 mM Gibco, Invitrogen 35050
TrypLE Express w/o phenol red Gibco, Invitrogen 12604
Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride Sigma Aldrich C6645
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich P6407
Laminin 1 mg/ml Millipore CC095
HEPES Sigma Aldrich H3375
Trypan Blue Stain 0.4% Gibco, Invitrogen 15250

Table IV. Specific reagents.

Equipment Company Cat. number
Stereo Microscope Olympus SZ61
Large Forceps FST 11022-14
Fine-tipped forceps Moria MC40B
Micro fine-tipped forceps Moria MC31
Razor-sharp scissors Roboz RS-6820
Micro Dissecting scissors FST 91460-11
Micro Dissecting Curved scissors FST 14067-11
Glass 2-chamber slides Lab-Tek 154461
60 mm dishes BD Falcon 353002
100 mm dishes Corning 430167
15 ml tubes BD Falcon 352099
1.5 ml cryo-tube vial Nunc 375353

Table V. Specific equipment.

References

  1. Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
  2. Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).
  3. Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons. Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).
  4. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
  5. Banker, G., Goslin, K. . Culturing nerve cells. , (1998).
  6. Eletto, D. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a. J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).
  7. Gualco, E. IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors. Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).
  8. Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
  9. Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
  10. Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).

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Cite This Article
Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol. J. Vis. Exp. (63), e3965, doi:10.3791/3965 (2012).

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