Для оценки функции и регуляции генов во время развития мозга дофаминергических нейронов, мы опишем метод, который включает в себя<em> В ово</em> Электропорации плазмидной конструкции ДНК в эмбриональных куриных вентральной предшественников мозга дофаминергических нейронов. Этот метод может быть использован для достижения эффективной экспрессии генов, представляющих интерес для изучения различных аспектов развития мозга и дофаминергической дифференциации нейронов.
Дофаминергических нейронов расположены в брюшной управления движением мозга, эмоциональное поведение и механизмы вознаграждения 1-3. Дисфункция мозга вентральной дофаминергических нейронов вовлечено в болезнь Паркинсона, шизофрения, депрессия и слабоумие 1-5. Таким образом, изучение регуляции дифференциации мозга дофаминергических нейронов не только обеспечивают важное понимание механизмов, регулирующих развитие мозга и нервной спецификации судьба предшественников, но и помочь в разработке новых терапевтических стратегий в лечении различных неврологических заболеваний человека.
Дофаминергических нейронов отличить от нейронных предшественников, выстилающих желудочковой зоны эмбрионального вентрального среднего мозга. Развитие нейронных предшественников контролируется экспрессия генов программы 6,7. Здесь мы сообщаем о методах использования электропорации выразить генов, в среднем мозге Гамбургера Гамильтон (HH) этап 11 (йirteen сомитов, 42 часов) куриных эмбрионов 8,9. Внешний развитие куриных эмбрионов позволяет удобно экспериментальных манипуляций в определенных эмбриональной стадии, последствия определяются на более позднем времени развития пунктов 10-13. Чик эмбриональной нервной трубы раньше, чем HH стадии 13 (девятнадцать сомитов, 48 часов) состоит из мультипотентных нейронных предшественников, которые способны дифференцироваться в различные типы клеток нервной системы. Вектор pCAG, который содержит промотор CMV и куриных β-актина усилитель, позволяющий для надежной выражение флаг или другой эпитоп с метками конструкций в эмбриональных куриных нейронных трубы 14. В этом докладе, мы подчеркиваем, специальные меры для обеспечения региональной ограниченной экспрессии генов в эмбриональных дофаминергических мозга предшественников нейронов, в том числе, как вводить ДНК создает в частности в области эмбрионального мозга и как определить электропорации с небольшой заказ электроды. Анализируя сзахолустный мозга на более поздних стадиях обеспечивает превосходную в естественных условиях система плазмиды вектор-опосредованного усиления из-функции и потерей функции исследования мозга развития. Модификация экспериментальная система может продлить анализа в других частях нервной системы, для проведения анализа и отображение судьбы для изучения регуляции экспрессии генов.
В ово электропорации эмбриональных мозга куриных предлагает недорогой и быстрой альтернативой поколение трансгенных животных или нокаут выполнять в естественных условиях изучения функций генов в мозге развития дофаминергических нейронов. Используя короткие длиной 2 мм L-ф…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим доктора Такахико Мацуда для обеспечения pCAG-mCherry построить. YCM поддерживается премии развития карьеры от Швеппе фонда и грант от фонда Whitehall.
Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
India ink | Staples | Filter 20% before use | |
Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |