Summary
기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을 설명
Abstract
복부 midbrain 제어 운동에 위치 Dopaminergic 뉴런, 정서적 행동, 및 보상 메커니즘 1-3. 복부 midbrain dopaminergic 신경 세포의 기능 장애는 파킨슨병, 정신 분열증, 우울증 및 치매 1-5 연관되어 있습니다. 따라서, midbrain dopaminergic 신경 세포의 분화의 조절을 연구하는 것은 midbrain 개발 및 신경 전구 운명 사양을 조절 메커니즘에 중요한 통찰력을만을 제공할 수 없습니다뿐만 아니라, 인간의 신경 장애의 다양한 치료를위한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이됩니다.
Dopaminergic 뉴런은 배아 복부 midbrain의 심실 영역에 즐비한 신경 progenitors에서 차별화. 신경 progenitors의 개발은 유전자 발현 프로그램 6,7에 의해 제어됩니다. 여기 (일 햄버거 해밀턴 (HH) 무대 11 midbrain에서 구체적으로 유전자를 표현하는 electroporation을 활용한 기술을보고irteen somites, 42 시간) 여자는 배아 8,9. 여자는 태아의 외부 개발은 나중에 발달 타임 포인트 10-13에서 결정된 효과를 특정 배아 단계에서의 편리하고 실험적인 조작을 위해 수 있습니다. 이전 HH 스테이지 13 (열아홉 somites 48 시간)보다 칙 배아 신경 튜브는 신경 시스템의 서로 다른 세포 유형으로 구별 능력이있다 multipotent 신경 progenitors로 이루어져 있습니다. CMV 프로 모터와 여자는 β-actin 향상제 모두 포함 pCAG 벡터는 국기 또는 배아 병아리 신경 튜브 14 기타 에피토프 태그가 추가된 구조의 강력한 표현을 허용합니다. 이 보고서에서 우리는 유전자가 배아 midbrain 지역으로 구체적으로 구성하고 어떻게 소규모 맞춤 전극과 electroporation를 정확하게하는 투입 방법을 포함하여 배아 midbrain dopaminergic 신경 세포의 progenitors에서 지역 제한된 유전자 발현을 달성할 수 있도록 특별한 조치를 강조한다. C 분석나중 단계에서 시골 midbrain는 플라스미드 벡터 중재의 이득의 기능 및 midbrain 개발 손실의 기능 연구를위한 생체내 시스템에 탁월한를 제공합니다. 실험 시스템의 변경은 운명 매핑 분석을 수행과 유전자 발현의 규정을 조사하는 신경계의 다른 부분에 검정을 연장할 수 있습니다.
Protocol
1. (없는 동영상)를 준비를 공급
- 1X PBS의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep)의 신선한 1X 희석을 준비합니다. 더 이상 50 ML이 필요합니다. 0.22 μm의 주사기 필터로 필터링합니다.
- 원하는 플라스미드 구조를 결합하여 사출 구조를 준비합니다. 우리는 ~ 10 μL의 최종 볼륨에 맞는 stoichiometry로 pCAG - 국기 벡터의 모든 구조를 넣어. 또한 pCAG-GFP 14 pCAG-mCherry는 추적 electroporation 효율과 electroporated 세포에 추가됩니다. 우리는이 실험 pCAG-mCherry을 사용합니다. 마지막으로, 태아의 여자는 midbrains로 주입 효율을 시각화하는 0.05 %의 최종 농도에서 플라스미드 DNA의 혼합물에 0.22 μm의 - 여과 빠른 그린 염료를 추가합니다.
2. 계란 준비 (비디오)
- HH 단계가 11 배아를 얻기 위해서는, 계란이 100에서 incubated해야 ° F (37.8 ° C) 25-40% 습도와 배입니다 41 시간 정도입니다. 장소그들의 측면에 계란 연필 대시로 각각의 상단을 표시합니다. 사전 예열, humidified 인큐베이터에서 트레이를 놓습니다. 천천히으로 인큐베이터 플랫폼의 회전 기능을 설정하여 난자를 흔들 "자동." 습도와 물 수준의 24 시간마다 확인합니다.
- 마우스 실험을 시작하기 전에, 인큐베이터에서 알을 제거하고 실온에 둡니다. 이것은 개발 속도를 느리게하고 개발을 통해 방지하는 데 도움이 될 것입니다.
- 70 % 에탄올로 각 계란의 표면을 깨끗이하고 Kimwipe로 아래로 닦으십시오.
- 스카치 테이프의 두 4cm의 조각을 가지고 연필 대쉬 이상의 큰 사각형을 만들기 위해 계란 위에 나란히 붙어 있어라. 계란에 대한 테이프를 부드럽게. 창이 이루어집니다 곳입니다. 테이프 창이 열려있는자를 때 떨어지부터 달걀 껍질의 작은 조각을 방지할 수 있습니다.
- 10 ML의 주사기와 18시 계란의 알부민 밖의 5 ML을 그릴 수있는 게이지 바늘을 사용합니다. 방해하지 않도록로 쉘을 피어싱 후, 노른자에서 떨어져 바늘 각도알부민 제거하는 동안이나 배아가 손상될. 계란 사이에 70 % 에탄올로 바늘을 청소하지만 바늘이 다음 계란을 피어싱하기 전에 건조해야합니다.
3. 유리 사출 니들 준비 (비디오)
- 주입 바늘이에서 다음 설정을 사용하여 만들어진 브라운 Micropipette 풀러 (셔터의 인스 트루먼트 모델 P-97) / 불타는 : 열량 670, 끌어 오기 120 벨 40 시간 165가. 세계 정밀 계측기 (API) 4 인치 1.0 mm 얇은 벽을 모세관 유리 (API TW100F-4)은 바늘을 만드는 데 사용됩니다.
- P10 피펫과 장기 팁 모세관로드 피펫 팁 (Eppendorf 5242956.003)을 사용하여 가져온 유리 바늘을로드합니다. 주입해야 얼마나 많은 계란에 따라 5-10 μL를로드합니다. 공기 거품의 부재 플라스미드 솔루션의 지속적인 열을 만드는 천천히 유리 바늘을 채웁니다.
- micromanipulator (Narishige MM3)와 Picospritzer III microinjector에 부착된 바늘 홀더에 로드된 바늘을 놓습니다. dissecti 아래 바늘보기현미경에서와 녹색 액체가 중지 지점에서 바늘을 잘라. 그것은 더 바늘을 시각화하기 위해 어두운 배경을 사용하는 데 도움이됩니다. 트리밍 적절한 바늘 연습이 함께 제공됩니다.
4. Midbrain / 신경 튜브 주입 (비디오)
- 계란의 2-2.5 cm 직경 창을 잘라 봄 가위를 사용하십시오. 알부민을 그릴 때 만든 이전 바늘 구멍에서 윈도우를 시작하고 잘라내으로 손에 계란을 돌린다. 계란 사이에 70 % 에탄올에 포화 Kimwipe으로 가위를 청소해야합니다.
- 해부 현미경 하에서 여자의 배아를 볼 수 있습니다. 그것은 눈을 훈련해야 할 수도 있습니다. 그것은 여자의 배아 아래 PBS에 0.22 μm의 - 여과 20% 인도 잉크를 주입함으로써 배아를 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 가능하다면 그것이 생존을 감소시키는 경향으로이 조치는, 피해야만 것으로 나타났습니다.
- 태아가 바늘의 경로를 병렬로 배치되는 경우 사출 거리 바늘의 머리와 함께 잘 작동됩니다.천천히 피어스 midbrain-hindbrain 접합에 45도 각도로 신경 튜브. 단지 forebrain 및 hindbrain 지역으로 크게 확산없이 플라스미드 DNA와 빠른 그린 염료로 midbrain을 나타내는 신경 소포를 작성하는 것은 매우 중요합니다. 25 MS에서 Picospritzer microinjector의 기간 세트 주사 시작, 이것은 바늘이 트리밍에 따라 변경해야 할 수도 있습니다. 일반적으로 10-50 MS 사이에 사용하십시오.
5. Electroporation (동영상)
- 주사 바늘을 검색합니다. 장 소 배아에서 난자의 PBS 용액에서 1X 펜 / Strep의 3 드랍스.
- BTX EMC830의 electroporator의 설정을 확인하십시오 :
전압 : 20 V 펄스 길이 : 25 MS # 펄스 : 3 간격 : 500 MS 극성 : - 둘을 갈라놓 3mm 전극 사이의 중간에 앉아 배아 midbrain과 함께 신경 튜브의 바닥과 같은 수평 레벨에서 2mm L-모양의 긴 백금 전극을 배치합니다. 신경 튜브의 바닥과 함께 전극을 정렬하면 복부 midbrain의 효율적인 electroporation에 중요합니다. midbrain 특정 electroporation을 달성하기 위해, 우리는 짧은 2mm 길이 팁 두 개의 사용자 정의 만든 백금 L-모양의 전극으로 원래 BTX 전극을 대체했습니다. 이러한 백금 전극은 0.5mm 직경 백금 와이어 (알파 Aesar)으로 만들어집니다. 이러한 백금 전극은 충분히 많은 forebrain 또는 hindbrain 지역의 타겟팅을하지 않고 길이 약 0.9 mm이며 무대 11 여자의 배아의 midbrain을 가릴 수 있습니다. BTX footswitch을 한 번 누르십시오. 공기 방울은 각 성공적인 electroporation과 전극 주위에 생성되어야한다. 조심스럽게 난자에서 전극을 제거하고 electr 닦아70 % 에탄올 덮여 Kimwipe 달아 odes. 배아에서 난자의 1X 펜 / Strep 솔루션의 또 다른 3 방울을 넣으십시오.
- 투명 포장 테이프 X 5cm 조각 5cm로 창을 커버. 물론 그 달걀을 봉쇄하라는 계란 내용이 테이프와 접촉하지 않도록하십시오.
6. 부화 및 수확
- 인큐베이터에 다시 계란을 넣습니다. 인큐베이터 플랫폼의 모퉁이가 꺼져 있는지 확인하십시오. 원하는 HH 단계 23이 달성될 때까지 알을 품어.
- 추수 생활 배아는 각각의 조건에 관한 일반적인 PBS-채워진 배양 접시에 넣어. 화면 mCherry 표현식에서만 배아를 유지, 형광 해부 현미경 하에서 배아를 수확.
- 24 잘 요리의 개별 우물로 배아를 전송합니다. 갓 만들어진 2 % paraformaldehyde (PFA) 1 ML 각 우물을 입력하고 4에 2~3시간를 해결할 수 있도록 ° C.
- 십분 PBS에 각각 고정 배아 세 번 씻는다. 장소 배아 순차적 IN 15% 및 equilibrated까지 30 % 자당. 태아는 처음 자당에 떠 있지만 평균시 싱크됩니다.
- 각각의 배아에 대한 mCherry 표현 패턴과 수준에 메모를 복용, 형광 해부 현미경 하에서 배아를 확인하십시오. 10월 각 배아를 포함시킵니다. 그것은 제대로 후속 분석 (그림 1)에 대한 최적의 midbrain의 크로스 섹션을 생성하여 동양의 배아에 매우 중요합니다.
- Leica CM3050S의 그라 이오 스탯을 사용하여 18 μm의 두께 midbrain 섹션을 준비합니다. 적절한 셀 타입의 마커로 immunostaining하여 midbrain 개발 및 dopaminergic 신경 세포의 분화를 분석합니다.
7. 대표 결과
태아의 여자는 midbrain을 electroporating 및 분석 도표 표현은 그림 1에 표시됩니다. 성공적으로 주입하고 electroporated 여자는 배아에서 mCherry 표현은 앞으로의 개발 이후 midbrain 지역에서 볼 수 있어야합니다 (
부족 mCherry 표현은 자궁외 유전자 가능성이 효과적으로 표현하지 않는 것이 좋습니다. 이 조건 하에서 태아도 더 공부를 사용할 수 없습니다. 마찬가지로, 배아 그실험 절차의 끝에 생존하지 않은 것은 데이터 수집 및 분석을 위해 사용할 수 없습니다.
그림 1. 비켜 electroporation 분석의 배아 여자는 midbrain의 일러스트. HH 단계 11 배아 여자는 배아는 () 사출 공정을 시각화하는 빠른 녹색 섞인 관심있는 유전자 함께 pCAG-mCherry으로 주입됩니다. DNA의 구조 가득 후 midbrains는 사각형 웨이브 electroporator로 electroporated있다. 원하는 HH 단계 23에 도달할 때까지 태아도 더 incubated됩니다. 그런 다음 mCherry - 긍정적인 배아는 수확 고정 및 임베디드 (B)됩니다. Midbrain의 cryosections는 그림 1B의 흰색 라인에 표시된 비행기를 절단으로 준비하고, 같은 티로신 Hydroxylase (TH) (C)와 같은 midbrain 표시에 immunostaining으로 분석된다. 여기를 클릭하십시오큰 그림을 볼 수 있습니다.
그림 2. 배아 여자는 midbrain에서 cryosections의 작성. 41시간 보육 후에 mCherry 및 관심있는 유전자를 표현 HH 단계 23 여자의 배아는 PFA로 고정되어 자당로 치료하고, cryosectioning 위해 10월에 박혀 (A, B 및 C) 수확한다. 칙의 배아는 신중 midbrain 섹션의 준비를 보장하기 위해 지향하고 있습니다. midbrain 섹션을 얻기위한 전형적인 배아 형태 및 절단 비행기 (D) 표시됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
그림 3. electroporated midbrain 섹션의 분석. mCherry 표현의 높은 수준과 배아에서 Cryosections은 () antibod 함께 준비하고 묻은 게있다관심의 국기 태그가 추가된 유전자 (B) 및 midbrain dopaminergic 신경 세포 마커 TH (C)를 인식 이거야. pCAG - mCherry 및 pCAG - 국기 빈 벡터 제어의 역할과 electroporated 배아의 midbrains 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
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Discussion
태아의 여자는 midbrain의 비켜 electroporation의는 낮은 비용과 midbrain dopaminergic 신경 세포 개발의 유전자 기능의 생체내 연구에서 수행하는 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 생성에 대한 빠른 대안을 제공합니다. 배아 midbrain 특정 DNA를 주입 함께 짧은 2mm에게 패 모양의 긴 백금 전극을 사용하면 midbrain dopaminergic 신경 세포의 progenitors에 대한 관심의 유전자의 효율적인 표현을 달성하기위한 열쇠입니다. 또한, 올바른 HH 단계 11 여자의 배아를 사용하는 것이 중요합니다. 먼저 HH 단계 11 시에, 여자는 midbrain의 개발 forebrain, midbrain, 그리고 hindbrain가 morphologically 구별할 수있는 것으로 충분 같은 고급되어 있기 때문입니다. 이것은 주사 바늘과 전극 midbrain 지역에서, 따라서 효율적인 DNA를 주입하고 transfection의 정확한 위치를 얻을 수 있습니다. 둘째, HH 단계 11 시에, 여자는 배아의 앞부분은 neuropore 아직 완전히 닫을 수 없습니다D, 주입 플라스미드 DNA를 쉽게 midbrain 지역으로 구체적으로 입력할 수 있도록합니다. 배아 forebrain, midbrain과 hindbrain 사이의 좁은 분기점은 또한 빠른 DNA의 확산 midbrain에 구체적으로 주입 구조를 방지하는 데 도움이됩니다. 마지막으로, 나중 단계에서 배아는 매우 어려운 midbrain에서 구체적으로 전극을 타겟으로 만드는 신경 축의 측면에 그들의 머리를 곱슬 곱슬하는 경향이 있습니다. 11 배아를 얻는 HH 개최하는 데 필요한 배양 시간은 배양 온도 편차뿐만 아니라 계란 사이의 자연적인 차이에 대한 응답으로 약간 다를 수 있습니다. 우리의 실험 조건에서 그것이 100에서 41 시간 정도 보육 소요 ° F로
분석을 위해 태아의 여자는 midbrain 섹션을 얻으려면 내장하고 올바른 방향으로 midbrains을 삭감하는 것은 매우 중요합니다. 마흔 일시간 electroporation 후, 여자는 배아는 종종 2 차원 그림과 유사한 형태를 표시합니다. 함께 cryosections 준비그림 2D에 표시된 것과 비행기 평행을 삭감하는 것은 더욱 immunostaining과 부량에 대한 정확한 midbrain 섹션을 얻는 기회를 극대화.
midbrain 특정 자궁외 유전자 발현이 electroporation에 의해 달성될 수있다는 사실은이 접근법은 중추 신경계의 다른 영역에 적용할 수있는 가능성을 엽니다. 분사의 위치뿐만 아니라 전극의 위치는 상당히 효율적으로 DNA의 구조 7,15로 transfected되는 뇌 영역에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 기술은 또한 RNAi-매개 최저 16, midbrain에서 특정 유전자 발현을 감소시키는 유용합니다. 마찬가지로, 약간 수정 기법,지도를 식별하고, 여자의 유전자로부터 새로운 규제 영역을 특성화하기 위해 리포터 유전자에 링크된 강화제를 표현함으로써 유전자 조절 연구를 구현할 수 있습니다. 마우스 배아에 적용하면이 기술을 더 빠를 것입니다쉽게 고전적인 형질 전환 방법보다 사용합니다.
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Disclosures
저자는 공개하지 잠재적인 충돌 관심이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 pCAG-mCherry가 만들지 제공해 주셔서 박사 Takahiko 마츠다 감사드립니다. YCM은 Schweppe 재단의 경력 개발 대상과 관청 재단의 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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