Summary

В ово Электропорация в Chick мозга для изучения функции генов в развитии дофаминергической Нейрон

Published: August 03, 2012
doi:

Summary

Для оценки функции и регуляции генов во время развития мозга дофаминергических нейронов, мы опишем метод, который включает в себя<em> В ово</em> Электропорации плазмидной конструкции ДНК в эмбриональных куриных вентральной предшественников мозга дофаминергических нейронов. Этот метод может быть использован для достижения эффективной экспрессии генов, представляющих интерес для изучения различных аспектов развития мозга и дофаминергической дифференциации нейронов.

Abstract

Дофаминергических нейронов расположены в брюшной управления движением мозга, эмоциональное поведение и механизмы вознаграждения 1-3. Дисфункция мозга вентральной дофаминергических нейронов вовлечено в болезнь Паркинсона, шизофрения, депрессия и слабоумие 1-5. Таким образом, изучение регуляции дифференциации мозга дофаминергических нейронов не только обеспечивают важное понимание механизмов, регулирующих развитие мозга и нервной спецификации судьба предшественников, но и помочь в разработке новых терапевтических стратегий в лечении различных неврологических заболеваний человека.

Дофаминергических нейронов отличить от нейронных предшественников, выстилающих желудочковой зоны эмбрионального вентрального среднего мозга. Развитие нейронных предшественников контролируется экспрессия генов программы 6,7. Здесь мы сообщаем о методах использования электропорации выразить генов, в среднем мозге Гамбургера Гамильтон (HH) этап 11 (йirteen сомитов, 42 часов) куриных эмбрионов 8,9. Внешний развитие куриных эмбрионов позволяет удобно экспериментальных манипуляций в определенных эмбриональной стадии, последствия определяются на более позднем времени развития пунктов 10-13. Чик эмбриональной нервной трубы раньше, чем HH стадии 13 (девятнадцать сомитов, 48 часов) состоит из мультипотентных нейронных предшественников, которые способны дифференцироваться в различные типы клеток нервной системы. Вектор pCAG, который содержит промотор CMV и куриных β-актина усилитель, позволяющий для надежной выражение флаг или другой эпитоп с метками конструкций в эмбриональных куриных нейронных трубы 14. В этом докладе, мы подчеркиваем, специальные меры для обеспечения региональной ограниченной экспрессии генов в эмбриональных дофаминергических мозга предшественников нейронов, в том числе, как вводить ДНК создает в частности в области эмбрионального мозга и как определить электропорации с небольшой заказ электроды. Анализируя сзахолустный мозга на более поздних стадиях обеспечивает превосходную в естественных условиях система плазмиды вектор-опосредованного усиления из-функции и потерей функции исследования мозга развития. Модификация экспериментальная система может продлить анализа в других частях нервной системы, для проведения анализа и отображение судьбы для изучения регуляции экспрессии генов.

Protocol

1. Поставка Подготовка (не видео) Подготовить новую 1X разведения пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep) в 1X PBS. Не более 50 мл необходимо. Фильтр с 0,22 мкм фильтр шприца. Подготовка инъекций конструкции путем объединения желаемого плазмиды конструкций. Ставим все конструкции в pCAG-Fla…

Discussion

В ово электропорации эмбриональных мозга куриных предлагает недорогой и быстрой альтернативой поколение трансгенных животных или нокаут выполнять в естественных условиях изучения функций генов в мозге развития дофаминергических нейронов. Используя короткие длиной 2 мм L-ф…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим доктора Такахико Мацуда для обеспечения pCAG-mCherry построить. YCM поддерживается премии развития карьеры от Швеппе фонда и грант от фонда Whitehall.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Fertilized chicken eggs Charles River Laboratories    
Egg incubator GQF Manufacturing 1502 Sportsman  
BTX Electroporator BTX Harvard Apparatus ECM830  
Electrodes BTX Harvard Apparatus 45-0162 L-shaped genetrodes For use with ECM830 electroporator
Platinum iridium wire Alfa Aesar #10056 0.5 mm diameter
For making the 2 mm long electrodes
Glass capillary tube World Precision Instrument TW100F-4  
Microloader pipette tip Eppendorf 5242 956.003  
India ink Staples   Filter 20% before use
Microinjector Parker Automation,
Parker Hannifin Cooperation
Picospritzer III  
Fluorescent dissection microscope Leica MZ16F  
Micropipette puller Sutter Instrument D-97  

References

  1. Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
  2. Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
  3. Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
  4. Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
  5. Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
  6. Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
  7. Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
  9. Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
  10. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
  11. Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  12. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  13. Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
  14. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
  15. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
  16. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).

Play Video

Cite This Article
Yang, B., Geary, L. B., Ma, Y. In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development. J. Vis. Exp. (66), e4017, doi:10.3791/4017 (2012).

View Video