В ово Электропорация в Chick мозга для изучения функции генов в развитии дофаминергической Нейрон
Summary
Для оценки функции и регуляции генов во время развития мозга дофаминергических нейронов, мы опишем метод, который включает в себя<em> В ово</em> Электропорации плазмидной конструкции ДНК в эмбриональных куриных вентральной предшественников мозга дофаминергических нейронов. Этот метод может быть использован для достижения эффективной экспрессии генов, представляющих интерес для изучения различных аспектов развития мозга и дофаминергической дифференциации нейронов.
Abstract
Дофаминергических нейронов расположены в брюшной управления движением мозга, эмоциональное поведение и механизмы вознаграждения 1-3. Дисфункция мозга вентральной дофаминергических нейронов вовлечено в болезнь Паркинсона, шизофрения, депрессия и слабоумие 1-5. Таким образом, изучение регуляции дифференциации мозга дофаминергических нейронов не только обеспечивают важное понимание механизмов, регулирующих развитие мозга и нервной спецификации судьба предшественников, но и помочь в разработке новых терапевтических стратегий в лечении различных неврологических заболеваний человека.
Дофаминергических нейронов отличить от нейронных предшественников, выстилающих желудочковой зоны эмбрионального вентрального среднего мозга. Развитие нейронных предшественников контролируется экспрессия генов программы 6,7. Здесь мы сообщаем о методах использования электропорации выразить генов, в среднем мозге Гамбургера Гамильтон (HH) этап 11 (йirteen сомитов, 42 часов) куриных эмбрионов 8,9. Внешний развитие куриных эмбрионов позволяет удобно экспериментальных манипуляций в определенных эмбриональной стадии, последствия определяются на более позднем времени развития пунктов 10-13. Чик эмбриональной нервной трубы раньше, чем HH стадии 13 (девятнадцать сомитов, 48 часов) состоит из мультипотентных нейронных предшественников, которые способны дифференцироваться в различные типы клеток нервной системы. Вектор pCAG, который содержит промотор CMV и куриных β-актина усилитель, позволяющий для надежной выражение флаг или другой эпитоп с метками конструкций в эмбриональных куриных нейронных трубы 14. В этом докладе, мы подчеркиваем, специальные меры для обеспечения региональной ограниченной экспрессии генов в эмбриональных дофаминергических мозга предшественников нейронов, в том числе, как вводить ДНК создает в частности в области эмбрионального мозга и как определить электропорации с небольшой заказ электроды. Анализируя сзахолустный мозга на более поздних стадиях обеспечивает превосходную в естественных условиях система плазмиды вектор-опосредованного усиления из-функции и потерей функции исследования мозга развития. Модификация экспериментальная система может продлить анализа в других частях нервной системы, для проведения анализа и отображение судьбы для изучения регуляции экспрессии генов.
Protocol
Discussion
В ово электропорации эмбриональных мозга куриных предлагает недорогой и быстрой альтернативой поколение трансгенных животных или нокаут выполнять в естественных условиях изучения функций генов в мозге развития дофаминергических нейронов. Используя короткие длиной 2 мм L-ф…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Такахико Мацуда для обеспечения pCAG-mCherry построить. YCM поддерживается премии развития карьеры от Швеппе фонда и грант от фонда Whitehall.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
