Summary
Pour évaluer la fonction et la régulation des gènes lors du développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale, nous décrivons une méthode qui consiste à
Abstract
Les neurones dopaminergiques situés dans le mouvement de lutte mésencéphale ventral, le comportement affectif, et les mécanismes de récompense 1-3. Le dysfonctionnement de la ventrale du mésencéphale dopaminergique neurones est impliquée dans la maladie de Parkinson, la schizophrénie, la dépression et la démence 1-5. Ainsi, l'étude de la régulation de la différenciation des neurones dopaminergiques du mésencéphale pourrait non seulement fournir des indications importantes sur les mécanismes régulant le développement des neurones du mésencéphale et la spécification sort géniteur, mais aussi aider à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter une variété de troubles neurologiques de l'homme.
Les neurones dopaminergiques différencier de progéniteurs neuronaux qui bordent la zone ventriculaire du mésencéphale ventral embryonnaire. Le développement des progéniteurs neuronaux est contrôlé par des programmes d'expression génique 6,7. Nous rapportons ici les techniques qui utilisent l'électroporation pour exprimer des gènes spécifiquement dans le mésencéphale de Hamburger Hamilton (HH) étape 11 (esomites irteen, 42 heures) les embryons de poulet 8,9. Le développement externe d'embryons de poulet permet de pratiques spécifiques à des manipulations expérimentales stades embryonnaires, avec des effets déterminés à des moments plus tard, de développement 10-13. Poussin tubes neuraux embryonnaires antérieures à l'étape SA 13 (dix-neuf somites, 48 heures) sont constitués de cellules progénitrices neurales pluripotentes qui sont capables de se différencier en cellules types distincts du système nerveux. Le vecteur pCAG, qui contient à la fois un promoteur CMV et un poussin β-actine enhancer, permet l'expression robuste de drapeau ou d'autres constructions épitope-étiquette dans des tubes de poulet embryonnaires neurales 14. Dans ce rapport, nous insistons sur les mesures spéciales pour parvenir à l'expression des gènes au niveau régional restreint dans embryonnaires du mésencéphale progéniteurs neuronaux dopaminergiques, y compris comment injecter de l'ADN construit spécifiquement dans la région du mésencéphale embryonnaire et comment repérer électroporation avec de petites électrodes sur-mesure. Analyser cmésencéphale hick à des stades ultérieurs fournit une excellente système in vivo pour plasmide vecteur à médiation de gain de fonction et de la perte de fonction des études de développement mésencéphale. Modification du système expérimental peut prolonger le test à d'autres parties du système nerveux pour effectuer une analyse de cartographie et d'enquêter sur le sort de la régulation de l'expression génique.
Protocol
1. Fourniture de préparation (pas dans la vidéo)
- Préparer une dilution fraîche 1X de pénicilline / streptomycine (Pen / Strep) dans du PBS 1X. Pas plus de 50 ml est nécessaire. Filtrer avec un filtre de 0,22 um seringue.
- Préparer des constructions d'injection en combinant souhaités constructions plasmidiques. Nous avons mis toutes les constructions dans le vecteur pCAG-Drapeau, avec une stoechiométrie appropriée pour un volume final de 10 uL ~. En outre, pCAG-GFP 14 ou pCAG-mCherry devrait être ajouté pour une efficacité d'électroporation de suivi et de cellules électroporées. Nous utilisons pCAG-mCherry pour cette expérience. Enfin, ajouter 0,22 um-filtrée de colorant vert rapide dans le mélange d'ADN plasmidique à une concentration finale de 0,05% à visualiser l'efficacité d'injection dans midbrains chiches embryonnaires.
2. Préparation des oeufs (en vidéo)
- Dans le but d'acquérir étape HH 11 embryons, les oeufs doivent être incubés à 100 ° F (37,8 ° C) pendant environ 41 heures après la fécondation avec une humidité de 25-40%. Lieuoeufs, de leur côté et marquer le début de chaque tableau de bord avec un crayon. Placez les plateaux dans un pré-chauffé, incubateur humidifié. Lentement balancer des oeufs en réglant la fonction de rotation de plates-formes incubateur pour "Automatique". Vérifier le niveau d'humidité et l'eau toutes les 24 heures.
- Juste avant de commencer l'expérience, retirer les oeufs de l'incubateur et laisser à température ambiante. Cela aidera à ralentir le développement et prévenir plus de développement.
- Nettoyer la surface de chaque œuf avec de l'éthanol 70% et essuyer avec un Kimwipe.
- Prenez deux 4 pièces cm de scotch et de les coller côte à côte sur l'œuf de faire un grand rectangle sur le tableau de bord crayon. Lisser la bande contre l'œuf. C'est là que la fenêtre ne sera effectué. La bande empêche petits morceaux de coquille d'oeuf de tomber lorsque la fenêtre est découpé.
- Utilisez une seringue de 10 ml et 18 ½ aiguille de la jauge de tirer 5 mL de sortir l'albumine de l'œuf. Après avoir percé la coque, l'angle de l'aiguille loin de la jaune à ne pas perturberou endommager l'embryon tout en retirant l'albumine. Nettoyez l'aiguille avec de l'éthanol à 70% entre les œufs, mais assurez-vous que l'aiguille est sec avant de percer l'œuf suivant.
3. Préparation de verre aiguille d'injection (en vidéo)
- Les aiguilles ne sont faites en utilisant les paramètres suivants sur une Flaming / Brown Micropipette Puller (modèle d'instrument Sutter P-97):. De chaleur 670, Pull 120, Vel 40, heure 165 Mondiale Precision Instruments (API) 4 pouces de 1,0 mm à paroi mince capillaire en verre (API TW100F-4) est utilisé pour faire des aiguilles.
- Chargez une aiguille de verre tiré à l'aide d'une pipette P10 et le long bout de capillaire de chargement de pointes de pipettes (Eppendorf 5,242,956,003). Chargez ul 5-10, en fonction du nombre d'oeufs destinés à être injectés. Remplir le verre de l'aiguille lentement, créant une colonne continue de solution de plasmide absente de bulles d'air.
- Placer l'aiguille chargée dans le porte-aiguille fixée à la micromanipulateur (Narishige MM3) et le micro-injecteur Picospritzer III. Voir l'aiguille sous un dissectisur microscope et de l'assiette de l'aiguille à l'endroit où le fluide vert cesse. Il permet d'utiliser un fond sombre pour mieux visualiser l'aiguille. Aiguille appropriée coupe vient avec la pratique.
4. Mésencéphale / injection du tube neural (en vidéo)
- Utilisez des ciseaux à ressort pour couper une fenêtre de 2-2,5 cm de diamètre dans l'œuf. Début de la fenêtre de la précédente trou d'aiguille fait lors de l'élaboration d'albumine, et faire tourner l'oeuf dans votre main que vous coupez. Assurez-vous de nettoyer les ciseaux avec un Kimwipe saturée dans de l'éthanol à 70% entre les œufs.
- Voir les embryons de poulet sous un microscope à dissection. Il peut être nécessaire de former les yeux. Il peut aider à visualiser l'embryon en injectant 0,22 um-filtrée d'encre de 20% en Inde dans le PBS en vertu de l'embryon de poulet. Toutefois, nous avons constaté que cette étape devrait être évité autant que possible, car il tend à diminuer la survie.
- Injection est plus efficace si l'embryon est positionné en parallèle à la trajectoire de l'aiguille, avec la tête loin de l'aiguille.Lentement percer le tube neural à un angle de 45 degrés à la jonction mésencéphale-rhombencéphale. Il est très critique à ne remplir que la vésicule neurones représentant du mésencéphale avec l'ADN plasmidique et rapide colorant vert, sans diffusion significative dans les régions du cerveau antérieur et postérieur. Commencer à injecter avec la durée de l'ensemble de micro-injecteur Picospritzer de moins 25 ms, ce qui peut être nécessaire de modifier en fonction de l'aiguille coupe. En général, utiliser entre 10-50 ms.
5. L'électroporation (en vidéo)
- Récupérer l'aiguille d'injection. Placer 3 gouttes de Pen 1X / Strep dans une solution de PBS dans l'œuf sur l'embryon.
- Vérifiez les paramètres de la électroporateur BTX EMC830:
TENSION: 20 V Durée d'impulsion: 25 ms IMPULSIONS #: 3 INTERVALLE: 500 ms POLARITE: - Placer les électrodes de platine de 2 mm de long en forme de L au même niveau horizontal que le fond du tube neural, avec le mésencéphale embryonnaire assis au milieu entre deux électrodes de 3 mm en dehors. Aligner les électrodes avec le fond du tube neural est critique pour l'électroporation efficace du mésencéphale ventral. Pour atteindre le mésencéphale spécifique électroporation, nous avons remplacé les électrodes d'origine BTX avec deux faits sur platine en forme de L avec électrodes courtes 2 mm pointes longues. Ces électrodes de platine sont en 0.5mm de diamètre (fils de platine Alfa Aesar). Ces électrodes de platine sont juste assez longtemps pour couvrir le mésencéphale d'un embryon de poulet étape 11, qui est d'environ 0,9 mm de long, sans cibler une grande partie de la ou des régions du cerveau antérieur rhombencéphale. Appuyez sur la pédale BTX fois. Les bulles d'air doivent être générés autour des électrodes avec chaque électroporation réussie. Retirez délicatement les électrodes de l'œuf et essuyez l'électrodes avec un Kimwipe 70% d'éthanol-couverte. Placez un autre 3 gouttes de Pen 1X / solution Strep dans l'œuf, sur l'embryon.
- Couvrez la fenêtre avec un 5 cm x 5 cm pièce de ruban d'emballage transparent. Assurez-vous de sceller l'œuf bien et que le contenu des œufs ne viennent pas en contact avec la bande.
6. Incuber et Harvest
- Placez les oeufs de retour dans l'incubateur. Assurez-vous que le tournage de plates-formes incubateur est OFF. Incuber les œufs jusqu'à ce que le stade de croissance désiré HH 23 est atteint.
- Les embryons vivants de récolte et de les placer dans des boîtes de Pétri communes du PBS-remplis pour chaque condition. Ecran récolté embryons en vertu d'un microscope à dissection fluorescente, en gardant seulement les embryons avec l'expression mCherry.
- Transfert d'embryons dans des puits individuels d'un plat de 24 puits. Remplir chaque puits avec 1 ml de paraformaldéhyde 2% fraîchement préparée (PFA) et permettent de fixer les 2-3 heures à 4 ° C.
- Laver embryons fixes trois fois pendant 10 minutes chacun dans du PBS. Embryons de manière séquentielle in 15% et 30% de saccharose jusqu'à équilibrée. Les embryons seront d'abord flotter dans du saccharose, mais va couler sur l'équilibration.
- Vérifiez embryons en vertu d'un microscope à dissection fluorescente, prenant des notes sur le modèle d'expression et le niveau mCherry pour chaque embryon. Intégrer chaque embryon en oct. Il est très important pour les embryons d'orienter correctement afin de générer des sections optimales du mésencéphale pour des analyses ultérieures (figure 1).
- Préparer 18 um d'épaisseur à l'aide des sections du mésencéphale un cryostat Leica CM3050S. Analyser le développement du mésencéphale et la différenciation des neurones dopaminergiques par immunomarquage avec marqueurs appropriés de type de cellules.
7. Les résultats représentatifs
Une représentation schématique du électroporation et l'analyse du mésencéphale poussin embryonnaire est illustré à la figure 1. Dans les embryons de poulet avec succès injectés et électroporation, l'expression mCherry doit être visible dans la région du mésencéphale, après développement (
Expression mCherry insuffisante suggère que les gènes extra-utérines sont probablement pas exprimé efficacement. Les embryons de moins cette condition ne doit pas être utilisé pour des études ultérieures. De même, les embryons quin'a pas survécu à la fin de la procédure expérimentale ne peut pas être utilisé pour la collecte de données et d'analyse.
Figure 1. Illustration du mésencéphale poussin embryonnaire en test électroporation in ovo. HH étape 11 embryons de poulet embryonnaires sont injectés avec pCAG-mCherry avec les gènes d'intérêt mélangés avec vert rapide de visualiser le processus d'injection (A). Après avoir rempli avec des constructions d'ADN, sont midbrains électroporation avec un électroporateur onde carrée. Les embryons sont ensuite incubés jusqu'à l'étape souhaitée HH 23 est atteint. Puis mCherry-positifs embryons sont récoltés, fixé, et intégré (B). Cryosections mésencéphale sont préparés avec les plans de coupe indiquées par la ligne blanche dans la figure 1B, et analysées par immunomarquage avec des marqueurs du mésencéphale tels que la tyrosine hydroxylase (TH) (C). Cliquez icipour agrandir la figure.
Figure 2. Préparation de cryosections de mésencéphale embryonnaire de poulet. Après 41 heures d'incubation, HH embryons au stade poussin 23 exprimant mCherry et les gènes d'intérêt sont récoltées (A, B et C), fixé par l'IFP, traités avec du saccharose, et intégré dans l'OCT pour cryosectioning. Embryons de poulet sont soigneusement orientés pour assurer la préparation des sections du mésencéphale. Une morphologie embryonnaire typique et le plan de coupe pour l'obtention de sections du mésencéphale sont indiqués (D). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Analyse des sections du mésencéphale électroporées. Cryosections à partir d'embryons présentant des niveaux élevés d'expression mCherry (A) sont préparées et colorées avec antibods qui reconnaissent le drapeau-étiqueté gène d'intérêt (B) et le mésencéphale neurone dopaminergique marqueur TH (C). Midbrains embryonnaires électroporés avec pCAG-mCherry et pCAG-Drapeau vecteur vide servir de témoin. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Le électroporation in ovo de mésencéphale embryonnaire de poulet offre un faible coût et alternative rapide à la génération d'animaux transgéniques ou knock-out pour effectuer une étude in vivo des fonctions des gènes dans le mésencéphale neurone dopaminergique développement. Utilisation à court de 2 mm des électrodes de platine longues en forme de L avec injection d'ADN embryonnaire mésencéphale spécifique est la clé pour parvenir à une expression efficace du gène d'intérêt dans les progéniteurs neuronales dopaminergiques du mésencéphale. En outre, l'utilisation correctes HH embryons au stade de poulet 11 est critique. C'est parce que d'abord, au stade de HH 11, le développement du mésencéphale poussin est assez avancé de telle sorte que le cerveau antérieur, le mésencéphale, le rhombencéphale et sont morphologiquement distinguables. Cela permet pour le positionnement précis de l'aiguille d'injection et des électrodes dans la région du mésencéphale, et l'injection d'ADN ainsi efficace et la transfection. Deuxièmement, au stade de HH 11, le neuropore antérieure de l'embryon de poulet n'est pas encore complètement fermerd, permettant l'ADN plasmidique injecté d'entrer facilement en particulier dans la région du mésencéphale. Les jonctions étroites entre prosencéphale embryonnaire, le mésencéphale et rhombencéphale également aider à empêcher la diffusion rapide des constructions d'ADN injecté spécifiquement dans le mésencéphale. Enfin, les embryons à des stades ultérieurs ont tendance à se recourber leurs têtes sur le côté de l'axe neural, ce qui rend très difficile de cibler spécifiquement l'électrode au niveau du mésencéphale. Le temps d'incubation nécessaire à l'obtention HH étape 11 embryons peuvent varier légèrement en réponse aux écarts de température d'incubation, ainsi que les différences naturelles entre les oeufs. Dans nos conditions expérimentales, il faut environ 41 heures d'incubation à 100 ° F.
Pour obtenir embryonnaires sections du mésencéphale chiches pour l'analyse, l'incorporation et la coupe midbrains à l'orientation correcte est très critique. Quarante et une heures après l'électroporation, les embryons de poulet présentent souvent une morphologie similaire à la figure 2D. Préparation cryocoupes avec uncouper plan parallèle à celles indiquées à la figure 2D maximise les chances d'obtenir des sections du mésencéphale correctes pour immunomarquage et la quantification.
Le fait que le mésencéphale spécifique l'expression des gènes extra-utérine peut être réalisée par électroporation ouvre la possibilité que cette approche peut être appliquée à d'autres régions du système nerveux central. L'emplacement de l'injection, ainsi que le positionnement des électrodes, pourrait affecter de manière significative les régions du cerveau qui sont efficacement transfectées avec des constructions d'ADN 7,15. Cette technique peut également se révéler utile dans la réduction de l'expression du gène spécifique dans le mésencéphale par ARNi à médiation knockdown 16. De même, des techniques légèrement modifiés peuvent être mis en œuvre pour étudier la régulation de gènes en exprimant exhausteurs liés à des gènes rapporteurs pour repérer, cartographier et de caractériser de nouvelles régions régulatrices de gènes chez le poussin. Lorsqu'il est appliqué à des embryons de souris, cette technique serait beaucoup plus rapideet plus facile à utiliser que classiques des approches transgéniques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt potentiels à révéler contradictoires.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Takahiko Matsuda pour fournir le pCAG-mCherry construire. YCM est soutenu par une bourse de développement de carrière de la Fondation Schweppe et une subvention de la Fondation Whitehall.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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