Summary
لتقييم وظيفة وتنظيم الجينات خلال تطوير الخلايا العصبية الدوبامين المخ الأوسط، ونحن تصف الأسلوب الذي ينطوي
Abstract
الدوبامين الخلايا العصبية الموجودة في الدماغ المتوسط سيطرة حركة بطني، والسلوك العاطفي، وآليات المكافأة 1-3. متورط في اختلال وظيفي من بطني الدماغ المتوسط الدوبامين الخلايا العصبية في مرض باركنسون، والفصام، والاكتئاب، والخرف 1-5. وبالتالي، يمكن أن يدرس تنظيم تمايز الخلايا العصبية الدوبامين المخ الأوسط، ليس فقط توفير نظرة متبصرة في آليات تنظيم وتطوير الدماغ المتوسط العصبية مواصفات مصير السلف، ولكنها تساعد أيضا وضع استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية البشرية.
الخلايا العصبية الدوبامين العصبية تفرق من الأسلاف المبطنة لمنطقة البطين من الدماغ المتوسط بطني الجنينية. ويتم التحكم في تنمية الأسلاف العصبية من خلال برامج التعبير الجيني 6،7. هنا ننقل تقنيات استخدام electroporation في التعبير عن الجينات على وجه التحديد في الدماغ المتوسط من مرحلة هامبورغ (سمو) هاميلتون 11 (عشرةirteen somites، 42 ساعة) افراخ الدجاج 8،9. التنمية الخارجية من افراخ الدجاج يسمح التلاعب التجريبية مريحة في المراحل الجنينية محددة، مع تحديد الآثار في نقطة زمنية التنموية في وقت لاحق 10-13. كتكوت الأنابيب العصبية الجنينية في وقت سابق من صاحب السمو مرحلة 13 (19 somites، 48 ساعة) وتتكون من الأسلاف العصبية multipotent التي هي قادرة على التمييز إلى أنواع الخلايا المتميزة في الجهاز العصبي. الموجه pCAG، الذي يحتوي على كل مروج CMV وفرخ β-الأكتين محسن، ويسمح للتعبير قوي من العلم أو غيرها من البنى حاتمة الموسومة في أنابيب الفرخ العصبية الجنينية 14. في هذا التقرير، فإننا نؤكد تدابير خاصة لتحقيق المقيدة إقليميا التعبير الجيني في الخلايا العصبية الجنينية الأسلاف الدماغ المتوسط الدوبامين، بما في ذلك كيفية حقن الحمض النووي يبني على وجه التحديد في منطقة المخ الأوسط الجنينية وكيفية تحديد electroporation مع أقطاب كهربائية صغيرة مصنوعة خصيصا. تحليل جالدماغ المتوسط المتخلف في مراحل لاحقة توفر ممتازة في نظام الجسم الحي للناقلات البلازميد التي تتوسط فيها مكسب وظيفة، من والخسارة من وظيفة دراسات التنمية الدماغ المتوسط. قد تعديل نظام تجريبي تمديد الفحص إلى أجزاء أخرى من الجهاز العصبي لأداء مصير تحليل الخرائط وعن التحقيق في تنظيم التعبير الجيني.
Protocol
1. تزويد التحضير (وليس في الفيديو)
- يعد التخفيف من جديد 1X الستربتوميسين / البنسلين (القلم / بكتيريا) في برنامج تلفزيوني 1X. ما لا يزيد عن 50 مل هو ضروري. تصفية مع فلتر ميكرون حقنة 0.22.
- إعداد البنى حقن عن طريق الجمع بين ثوابت البلازميد المطلوب. نضع كل البنى في ناقلات pCAG، مع العلم الثاني الجزء النظري المناسب لحجم النهائي من ميكرولتر 10 ~. أيضا، يجب إضافة pCAG GFP-14 أو pCAG mCherry من أجل كفاءة electroporation تتبع والخلايا electroporated. نحن نستخدم pCAG-mCherry لهذه التجربة. وأخيرا، إضافة 0.22 ميكرون، تمت تصفيتها صبغ الأخضر سريع في خليط البلازميد بتركيز نهائي قدره 0.05٪ لتصل إلى تصور كفاءة الحقن في midbrains كتكوت الجنينية.
2. تحضير البيض (في الفيديو)
- من أجل الحصول على سمو مرحلة 11 الأجنة، والبيض يجب أن يتم تحضين على 100 درجة فهرنهايت (37.8 درجة مئوية) لمدة 41 ساعة بعد الإخصاب مع رطوبة 25-40٪. مكانالبيض الى جانبهم، وعلامة على رأس كل منهما مع اندفاعة قلم رصاص. وضع الصواني في حاضنة، قبل حرارة مرطب. صخرة البيض ببطء من خلال تحديد وظيفة تحول من المنصات الحاضنة إلى "تلقائي". تحقق من مستوى الرطوبة والمياه كل 24 ساعة.
- الحق قبل بدء التجربة، وإزالة البيض من الحاضنة وترك في درجة حرارة الغرفة. وهذا سوف يساعد على ابطاء التنمية ومنع أكثر من التنمية.
- تنظيف سطح كل واحدة منها مع الايثانول 70٪ والقضاء عليها مع Kimwipe.
- أخذ قطعتين 4 سم من الشريط سكوتش والتمسك بها جنبا إلى جنب على البيض لجعل مستطيل كبير على مدى اندفاع قلم رصاص. تمهيد الشريط ضد البيض. هذا هو المكان الذي سيتم من النافذة. والشريط منع قطع صغيرة من قشر البيض من السقوط عندما يتم قطع النافذة المفتوحة.
- استخدام الحقنة 10 مل و 18 ونصف إبرة مقياس لرسم 5 مل من خارج الألبومين للبيضة. بعد اختراق قذيفة، وزاوية الإبرة بعيدا عن صفار البيض حتى لا يزعجأو يضر الجنين أثناء إزالة الزلال. تنظيف إبرة مع الايثانول 70٪ بين البيض، ولكن تأكد من أن إبرة جافة قبل اختراق البويضة المقبل.
3. زجاج التحضير إبرة حقن (في الفيديو)
- مصنوعة إبر الحقن باستخدام الإعدادات التالية على المشتعلة / براون Micropipette بولير (سوتر الصك النموذجي P-97): الحرارة 670، سحب 120، فيل 40، الوقت 165 ويستخدم العالم أدوات دقيقة (API) 4 بوصة 1.0 ملم رقيقة الجدار الزجاجي الشعرية (API TW100F-4) لجعل الإبر.
- تحميل إبرة زجاج سحبت باستخدام ماصة P10 وطويلة طرف الشعرية التحميل ماصة معلومات سرية (إيبندورف 5242956.003). تحميل ميكرولتر 5-10، وهذا يتوقف على مدى العديد من البيض ليتم حقنه. شغل الإبرة الزجاج ببطء، وخلق عمود المستمر من حل البلازميد غائبة من فقاعات الهواء.
- وضع الإبرة المحملة في حامل إبرة تعلق على micromanipulator (Narishige MM3) والثالث microinjector Picospritzer. عرض إبرة تحت dissectiفي المجهر وتقليم إبرة في النقطة التي توقف السائل الأخضر. فهو يساعد على استخدام خلفية مظلمة لتصور أفضل الإبرة. إبرة مناسب وتقليم يأتي مع الممارسة.
4. الدماغ المتوسط / العصبية أنبوب حقن (في الفيديو)
- استخدام مقص لقطع ربيع قطره سم 2-2،5 نافذة في البويضة. بدء نافذة من ثقب إبرة السابقة التي عند رسم الزلال، وتدوير البيض في يدك وأنت تقطع. مما لا شك فيه لتنظيف قبالة مقص مع Kimwipe المشبعة في الايثانول 70٪ بين البيض.
- عرض افراخ الدجاج تحت المجهر تشريح. قد يكون من الضروري لتدريب العينين. فإنه قد تساعد على تصور الجنين من خلال ضخ 0.22 ميكرون، تمت تصفيتها حبر الهند بنسبة 20٪ في برنامج تلفزيوني تحت الجنين الفرخ. ومع ذلك، فقد وجدنا أنه ينبغي تجنب هذه الخطوة إذا كان ذلك ممكنا، لأنه يميل إلى تقليص البقاء على قيد الحياة.
- حقن يعمل بشكل أفضل إذا تم وضع الجنين في مواز لمسار الإبرة، مع رئيس بعيدا عن إبرة.بيرس ببطء في الأنبوب العصبي في زاوية 45 درجة إلى تقاطع الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر. من المهم جدا لملء فقط حويصلة العصبية التي تمثل الدماغ المتوسط مع البلازميد وصبغ الأخضر سريع، من دون نشر كبيرة في مناطق الدماغ الأمامي والدماغ المؤخر. بدء ضخ مع مجموعة لمدة microinjector Picospritzer وحتى 25 مللي، وهذا قد تحتاج إلى تغيير اعتمادا على إبرة التشذيب. بشكل عام، واستخدام ما بين 10-50 مللي.
5. Electroporation (في الفيديو)
- استرداد إبرة الحقن. مكان 3 قطرات من القلم 1X / بكتيريا في حل برنامج تلفزيوني في البيضة على الجنين.
- تحقق من إعدادات لelectroporator EMC830 BTX:
الجهد: 20 V طول النبض: 25 مللي البقول #: 3 الفاصل الزمني: 500 مللي قطبية: - وضع 2 مم أقطاب البلاتين طويل على شكل حرف L على مستوى أفقي نفس الجزء السفلي من الأنبوب العصبي، والدماغ المتوسط الجنينية يجلس في الوسط بين 3 مم باستثناء اثنين الأقطاب. التوفيق بين الأقطاب مع الجزء السفلي من الأنبوب العصبي هو أمر حاسم لelectroporation كفاءة المخ الأوسط بطني. لتحقيق الدماغ المتوسط محددة electroporation، استبدال نحن الأقطاب الأصلي BTX مع اثنين من أقطاب كهربائية مصنوعة خصيصا على شكل حرف L البلاتين مع نصائح مم القصير 2 طويل. وتتكون هذه الأقطاب من البلاتين 0.5mm أسلاك البلاتين القطر (ألفا Aesar). هذه الأقطاب الكهربائية البلاتينية هي فترة طويلة بما يكفي لتغطية الدماغ المتوسط من فرخ الجنين مرحلة 11، وهي عبارة عن 0.9 مم طويل، من دون استهداف الكثير من الدماغ الأمامي أو مناطق الدماغ المؤخر. اضغط على footswitch BTX مرة واحدة. وينبغي أن تولد فقاعات الهواء حول الأقطاب مع كل electroporation ناجحة. إزالة بعناية الأقطاب من البيض ويمسح إلكترونياتقصائد قبالة مع Kimwipe 70٪ من الإيثانول المغطاة. مكان آخر قطرات 3 من القلم 1X / حل بكتيريا في البيض، وعلى الجنين.
- تغطي نافذة مع الطول 5 × 5 سم قطعة من الشريط التعبئة والتغليف واضح. تأكد من اغلاق البيض جيدا، وأنه محتويات البيضة لا تأتي في اتصال مع الشريط.
6. احتضان والحصاد
- وضع البيض مرة أخرى في الحاضنة. تأكد من أن تحول من المنصات الحاضنة هو OFF. احتضان البيض إلى أن يتحقق مرحلة سمو المطلوب 23.
- حصاد الأجنة الحية ووضعها في أطباق بتري مشترك PBS مملوءة لكل حالة. شاشة حصاد الأجنة تحت المجهر تشريح فلوري، وحفظ الأجنة فقط مع التعبير mCherry.
- نقل الأجنة في الآبار الفردية من طبق 24 أيضا. ملء كل جيدا مع 1 مل من الطازجة بارافورمالدهيد 2٪ (منهاج العمل) والسماح لإصلاح 2-3 ساعات في 4 درجات مئوية.
- غسل الأجنة ثابت ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل برنامج تلفزيوني. الأجنة مكان بالتسلسل أنان 15٪ و 30٪ سكروز حتى معايرتها. وسوف تطفو الأجنة في البداية في السكروز، ولكن سوف تغرق على موازنة.
- فحص الأجنة تحت المجهر تشريح الفلورسنت، وتدوين الملاحظات على نمط ومستوى التعبير mCherry لكل جنين. تضمين كل جنين في أكتوبر من المهم جدا لأجنة توجيه صحيح لتوليد الأمثل المقاطع العرضية الدماغ المتوسط لتحاليل لاحقة (الشكل 1).
- إعداد 18 ميكرومتر أقسام الدماغ المتوسط سميكة باستخدام ناظم البرد CM3050S لايكا. تحليل تطور الدماغ المتوسط وتمايز الخلايا العصبية الدوبامين من قبل المناعية المناسبة مع علامات نوع من الخلايا.
7. ممثل النتائج
يظهر تمثيل شكلي من electroporating وتحليل الجنينية الدماغ المتوسط كتكوت في الشكل 1. في افراخ الدجاج يحقن بنجاح وelectroporated، وينبغي أن تكون واضحة mCherry التعبير في منطقة المخ الأوسط بعد مزيد من التطوير (
عدم كفاية التعبير mCherry تشير إلى أن من المحتمل الجينات خارج الرحم ليس عن كفاءة. لا ينبغي أن الأجنة تحت هذا الشرط يمكن استخدامها لإجراء المزيد من الدراسات. وبالمثل، أن الأجنةويمكن البقاء على قيد الحياة لا إلى نهاية الإجراء التجريبي لا يمكن استخدامها لجمع البيانات وتحليلها.
الشكل 1. توضيحات من المخ الأوسط كتكوت الجنينية في فحص electroporation البيضة. يتم حقن سمو مرحلة 11 افراخ الدجاج الجنينية مع pCAG-mCherry مع الجينات ذات الاهتمام الممزوج الأخضر سريع لتصور عملية حقن (A). بعد مليئة بنيات الحمض النووي، وelectroporated midbrains مع electroporator موجة مربع. يتم تحضين مزيد من الأجنة حتى يتم التوصل المطلوب سمو المرحلة 23. ثم يتم حصاد mCherry إيجابية الأجنة، ثابتة، وجزءا لا يتجزأ من (B). وتعد cryosections الدماغ المتوسط مع قطع الطائرات المشار إليها بواسطة خط أبيض في الشكل 1B، وتحليلها من قبل المناعية مع علامات الدماغ المتوسط مثل هيدروكسيلاز التيروسين (TH) (C). اضغط هنالمشاهدتها بشكل اكبر شخصية.
الشكل 2. إعداد cryosections من المخ الأوسط كتكوت الجنينية. بعد ساعة 41 حضانة، ويتم حصاد الأجنة سمو مرحلة كتكوت 23 معربا عن mCherry والجينات من الفائدة (A و B و C)، ثابتة مع منهاج العمل، وتعامل مع السكروز، وجزءا لا يتجزأ من أكتوبر لcryosectioning. موجهة بعناية افراخ الدجاج لضمان إعداد أقسام الدماغ المتوسط. وأظهرت مورفولوجيا جنين النموذجية وقطع من الطائرة من أجل الحصول على أقسام الدماغ المتوسط (D). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 3. تحليل أقسام الدماغ المتوسط electroporated. Cryosections من أجنة لديهم مستويات عالية من التعبير mCherry (أ) يتم إعداد وملطخة الأضدادالمنشأ التي تعترف العلم الموسومة الجينات من مصلحة (B) و الدماغ المتوسط الدوبامين العصبية TH علامة (C). midbrains الجنينية electroporated مع pCAG-mCherry وpCAG-علم ناقلات الفارغة بمثابة السيطرة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وفي electroporation البيضة من المخ الأوسط كتكوت الجنينية تقدم منخفضة التكلفة وبديل سريع لجيل من الحيوانات المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب لإجراء الدراسة المجراة من وظائف الجينات في تنمية الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط. باستخدام القصير 2 مم أقطاب البلاتين طويل على شكل حرف L مع الجنينية حقن الحمض النووي الدماغ المتوسط محددة هي المفتاح لتحقيق كفاءة التعبير من الجينات ذات الأهمية في الدماغ المتوسط أسلاف الخلايا العصبية الدوبامين. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام الصحيح الأجنة سمو مرحلة كتكوت 11 أمر بالغ الأهمية. وذلك لأن الأولى، في مرحلة سمو 11، وتقدمت على تطوير الدماغ المتوسط مثل الفرخ يكفي أن الدماغ المقدم، الدماغ المتوسط، والدماغ المؤخر ويمكن تمييزها شكليا. وهذا يسمح لتحديد المواقع بدقة من إبرة الحقن والأقطاب الكهربائية في منطقة المخ الأوسط، وكفاءة وبالتالي حقن الحمض النووي وترنسفكأيشن. الثانية، في مرحلة سمو 11، المسم العصبي الأمامي من جنين الفرخ ليس بعد إغلاقه تماماد، والسماح للحمض النووي حقن البلازميد للدخول بسهولة على وجه التحديد في منطقة المخ الأوسط. والتقاطعات الضيقة بين الدماغ الأمامي الجنينية، الدماغ المتوسط والدماغ المؤخر أيضا أن يساعد على منع انتشار سريع للحمض النووي يبني حقن تحديدا في الدماغ المتوسط. وأخيرا، أجنة في مراحل لاحقة تميل إلى رؤوسهم حليقة إلى جانب محور العصبية، مما يجعل من الصعب للغاية استهداف قطب على وجه التحديد في الدماغ المتوسط. ربما يكون الوقت الحضانة اللازمة للحصول على سمو استضافة 11 الأجنة تختلف قليلا في الرد على انحرافات في حرارة الحضانة، فضلا عن الاختلافات الطبيعية بين البيض. في ظل الظروف التجريبية لدينا، ويستغرق حوالي 41 ساعة حضانة عند 100 ° F.
للحصول على الجنينية أقسام الدماغ المتوسط كتكوت للتحليل، ودمج وقطع midbrains في الاتجاه الصحيح أمر حاسم جدا. واحد واربعين ساعة بعد electroporation، افراخ الدجاج عرض في كثير من الأحيان مورفولوجيا مماثل إلى الشكل 2D. إعداد cryosections معخفض مواز لتلك الطائرة هو مبين في الشكل 2D يزيد من فرصة للحصول على أقسام الدماغ المتوسط الصحيح لمزيد من المناعية النوعي والكمي.
حقيقة لا يمكن أن يتحقق الدماغ المتوسط محددة التعبير الجيني خارج الرحم بواسطة electroporation يفتح إمكانية أن يمكن تطبيق هذا النهج في مناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي. ويمكن الموقع من الحقن، وكذلك تحديد المواقع من الأقطاب الكهربائية، تؤثر تأثيرا كبيرا على مناطق الدماغ التي transfected بكفاءة مع بنيات الحمض النووي 7،15. قد يكون هذا الأسلوب يكون مفيدا أيضا في خفض محدد التعبير الجيني في الدماغ المتوسط بواسطة رني بوساطة ضربة قاضية 16. وبالمثل، يمكن تنفيذ تقنيات معدلة بشكل طفيف لدراسة تنظيم الجينات بالإعراب عن القدرة على ربط الجينات مراسل لتحديد وخريطة، وتوصيف مناطق تنظيمية جديدة من الجينات في الفرخ. عندما تطبق على أجنة الفئران، فإن هذا الأسلوب تكون أسرع بكثيروأسهل استخداما من النهج الكلاسيكي المعدلة وراثيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم مصالح متعارضة المحتملة للكشف.
Acknowledgments
نشكر الدكتور ماتسودا Takahiko لتوفير pCAG-mCherry بناء. معتمد من قبل YCM مهنة جائزة من مؤسسة التنمية Schweppe ومنحة من مؤسسة وايتهول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd edn, Elsevier. (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
