Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında
Summary
Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem tarif<em> Ovo içinde</emEmbriyonik civciv ventral orta beyin dopaminerjik nöron ataları içine plazmid DNA yapıları> elektroporasyon. Bu teknik, orta beyin gelişimi ve dopaminerjik nöron farklılaşma farklı yönlerini incelemek için ilgi genlerin etkili ifade elde etmek için kullanılabilir.
Abstract
Ventral orta beyin kontrolü hareketi bulunan dopaminerjik nöronlar, duygusal davranış ve ödül mekanizmaları 1-3. Ventral orta beyin dopaminerjik nöronların disfonksiyon, Parkinson hastalığı, şizofreni, depresyon, demans ve 1-5 rol oynar. Böylece, orta beyin dopaminerjik nöron farklılaşma yönetmelik okuyan orta beyin gelişimi ve nöral progenitör kaderi özellikleri düzenleyen mekanizmalar çok önemli ipuçları sadece sağlamaz, ama aynı zamanda insan nörolojik bozukluklar çeşitli tedavisi için yeni tedavi stratejileri geliştirmelerine yardımcı olur.
Dopaminerjik nöronların embriyonik ventral orta beyin içinde, ventriküler zon döşeyen sinirsel öncü hücrelerden ayırt. Sinir progenitörlerin gelişimi gen ifadesi programları 6,7 tarafından kontrol edilir. Burada (th Hamburger Hamilton (HH) evre 11 Ortabeyin özellikle genleri ifade elektroporasyon kullanan teknikleri raporirteen Somitlerin, 42 saat) civciv embriyolarının 8,9. Civciv embriyo gelişimi dış sonraki gelişim zaman noktalarında 10-13 belirlenen etkileri ile özgün embriyonik aşamalarında uygun deneysel manipülasyonlar, sağlar. Erken evre HH 13 (ondokuz Somitlerin, 48 saat) daha Chick embriyonik nöral tüp sinir sisteminin farklı hücre tiplerine farklılaşma yeteneğine sahiptirler multipotent nöral progenitörlerin oluşur. Bir CMV organizatörü ve bir civciv β-aktin artırıcı hem de içeren pCAG vektör, Bayrak veya embriyonik civciv nöral tüp 14 diğer epitop etiketli yapıları sağlam bir ifade verir. Bu yazıda, DNA embriyonik Ortabeyin bölgeye özel olarak inşa ve nasıl küçük ısmarlama elektrotlar ile elektroporasyon saptamak için nasıl enjekte dahil embriyonik orta beyin dopaminerjik nöron ataları, bölgesel açıdan kısıtlı gen elde etmek için özel önlemler üzerinde durulmuştur. C AnaliziDaha sonraki aşamalarda hödük Ortabeyin plazmid vektör aracılı kazanç fonksiyon-ve orta beyin gelişimi kaybı fonksiyon-çalışmaları için in vivo sistemde mükemmel bir sağlar. Deneysel sistem modifikasyonu kaderi haritalama analizi gerçekleştirmek için ve gen ifadesinin düzenlenmesinde araştırmak için sinir sisteminin diğer bölümlerine tahlil uzatabilir.
Protocol
Discussion
Embriyonik civciv orta beyin ve ovo elektroporasyon de düşük maliyet ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişiminde gen fonksiyonlarının in vivo çalışma gerçekleştirmek için transgenik veya bayıltıcı hayvanların nesli hızlı bir alternatif sunuyor. Embriyonik orta beyin-spesifik DNA enjeksiyonu ile birlikte kısa 2 mm L şeklinde uzun bir platin elektrot kullanarak orta beyin dopaminerjik nöron progenitörlerin ilgi geninin etkin ifadesi ulaşmak için anahtardır. Buna ek ola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz pCAG-mCherry inşa sağlamak için Dr Takahiko Matsuda teşekkür ederim. YCM Schweppe Vakfı'ndan bir Kariyer Geliştirme Ödülü ve Whitehall Foundation'ın tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
