لتقييم وظيفة وتنظيم الجينات خلال تطوير الخلايا العصبية الدوبامين المخ الأوسط، ونحن تصف الأسلوب الذي ينطوي<em> في البيضة</em> electroporation من بنيات البلازميد إلى الجنينية الأسلاف فرخ الدماغ المتوسط بطني الخلايا العصبية الدوبامين. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحقيق كفاءة التعبير عن الجينات ذات أهمية لدراسة الجوانب المختلفة للتنمية الدماغ المتوسط وتمايز الخلايا العصبية الدوبامين.
الدوبامين الخلايا العصبية الموجودة في الدماغ المتوسط سيطرة حركة بطني، والسلوك العاطفي، وآليات المكافأة 1-3. متورط في اختلال وظيفي من بطني الدماغ المتوسط الدوبامين الخلايا العصبية في مرض باركنسون، والفصام، والاكتئاب، والخرف 1-5. وبالتالي، يمكن أن يدرس تنظيم تمايز الخلايا العصبية الدوبامين المخ الأوسط، ليس فقط توفير نظرة متبصرة في آليات تنظيم وتطوير الدماغ المتوسط العصبية مواصفات مصير السلف، ولكنها تساعد أيضا وضع استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية البشرية.
الخلايا العصبية الدوبامين العصبية تفرق من الأسلاف المبطنة لمنطقة البطين من الدماغ المتوسط بطني الجنينية. ويتم التحكم في تنمية الأسلاف العصبية من خلال برامج التعبير الجيني 6،7. هنا ننقل تقنيات استخدام electroporation في التعبير عن الجينات على وجه التحديد في الدماغ المتوسط من مرحلة هامبورغ (سمو) هاميلتون 11 (عشرةirteen somites، 42 ساعة) افراخ الدجاج 8،9. التنمية الخارجية من افراخ الدجاج يسمح التلاعب التجريبية مريحة في المراحل الجنينية محددة، مع تحديد الآثار في نقطة زمنية التنموية في وقت لاحق 10-13. كتكوت الأنابيب العصبية الجنينية في وقت سابق من صاحب السمو مرحلة 13 (19 somites، 48 ساعة) وتتكون من الأسلاف العصبية multipotent التي هي قادرة على التمييز إلى أنواع الخلايا المتميزة في الجهاز العصبي. الموجه pCAG، الذي يحتوي على كل مروج CMV وفرخ β-الأكتين محسن، ويسمح للتعبير قوي من العلم أو غيرها من البنى حاتمة الموسومة في أنابيب الفرخ العصبية الجنينية 14. في هذا التقرير، فإننا نؤكد تدابير خاصة لتحقيق المقيدة إقليميا التعبير الجيني في الخلايا العصبية الجنينية الأسلاف الدماغ المتوسط الدوبامين، بما في ذلك كيفية حقن الحمض النووي يبني على وجه التحديد في منطقة المخ الأوسط الجنينية وكيفية تحديد electroporation مع أقطاب كهربائية صغيرة مصنوعة خصيصا. تحليل جالدماغ المتوسط المتخلف في مراحل لاحقة توفر ممتازة في نظام الجسم الحي للناقلات البلازميد التي تتوسط فيها مكسب وظيفة، من والخسارة من وظيفة دراسات التنمية الدماغ المتوسط. قد تعديل نظام تجريبي تمديد الفحص إلى أجزاء أخرى من الجهاز العصبي لأداء مصير تحليل الخرائط وعن التحقيق في تنظيم التعبير الجيني.
وفي electroporation البيضة من المخ الأوسط كتكوت الجنينية تقدم منخفضة التكلفة وبديل سريع لجيل من الحيوانات المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب لإجراء الدراسة المجراة من وظائف الجينات في تنمية الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط. باستخدام القصير 2 مم أقطاب ال…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور ماتسودا Takahiko لتوفير pCAG-mCherry بناء. معتمد من قبل YCM مهنة جائزة من مؤسسة التنمية Schweppe ومنحة من مؤسسة وايتهول.
Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
India ink | Staples | Filter 20% before use | |
Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |