Summary

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Published: August 03, 2012
doi:

Summary

Um die Funktion und die Regulation von Genen während der Entwicklung der dopaminergen Neurone im Mittelhirn zu bewerten, beschreiben wir eine Methode, die beinhaltet<em> In-ovo-</em> Elektroporation von Plasmid-DNA-Konstrukte in embryonale Küken ventralen Mittelhirn dopaminergen Neuronen Vorfahren. Diese Technik kann verwendet werden, um eine effiziente Expression von Genen des Interesses, um verschiedene Aspekte des Mittelhirns Entwicklung und Differenzierung dopaminergen Neuronen zu untersuchen.

Abstract

Dopaminergen Neuronen in der ventralen Mittelhirn Kontrolle Bewegung befindet, emotionales Verhalten und Belohnung Mechanismen 3.1. Die Dysfunktion des ventralen Mittelhirn dopaminergen Neuronen in der Parkinson-Krankheit, Schizophrenie, Depression und Demenz 5.1 verwickelt. So konnte die Untersuchung der Regulation der dopaminergen Mittelhirn-Neuronen Differenzierung nicht nur liefern wichtige Einblicke in die Mechanismen, die Mittelhirn Entwicklung und neuronale Vorläuferzellen Schicksal Spezifikation, sondern auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung einer Vielzahl von humanen neurologischen Erkrankungen.

Dopaminergen Neuronen differenzieren aus neuralen Vorläuferzellen entlang der ventrikulären Zone der embryonalen ventralen Mittelhirn. Die Entwicklung von neuralen Vorläuferzellen wird durch Genexpression 6,7 gesteuert. Hier berichten wir über Techniken der Verwendung von Elektroporation, um Gene gezielt zum Ausdruck bringen im Mittelhirn der Hamburger Hamilton (HH) Stufe 11 (thirteen Somiten, 42 Stunden) Hühnerembryonen 8,9. Die externe Entwicklung von Hühnerembryonen ermöglicht die komfortable experimentelle Manipulationen an bestimmten embryonalen Stadien, mit den Auswirkungen auf späteren Entwicklungsstadien Zeitpunkten 10-13 bestimmt. Küken embryonalen neuralen Röhren früher als HH Stadium 13 (neunzehn Somiten, 48 Stunden) bestehen aus multipotenten neuralen Vorläuferzellen zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen des Nervensystems sind. Die pCAG Vektor, der sowohl einen CMV-Promotor und ein Küken β-Actin-Enhancer enthält, kann für robuste Expression des Flag oder andere Epitop-markierten Konstrukte in Embryonenküken neuronalen Röhren 14. In diesem Bericht möchten wir betonen, besondere Maßnahmen zur regional begrenzten Gen-Expression in embryonalen dopaminergen Mittelhirn-Neuronen-Vorläuferzellen, einschließlich wie man injizieren DNA-Konstrukte gezielt in den embryonalen Mittelhirns Gegend und wie Elektroporation mit kleinen maßgeschneiderten Elektroden lokalisieren zu erreichen. Analysieren von chick Mittelhirn in späteren Stadien eine hervorragende in vivo für Plasmid-Vektor-vermittelte gain-of-Funktion und Loss-of-Funktions-Untersuchungen der Mittelhirn Entwicklung. Modifizierung des experimentellen System kann des Assays, anderen Teilen des Nervensystems erstrecken zum Durchführen Gastrula-Analyse und zur Untersuchung der Regulation der Genexpression.

Protocol

1. Versorgung Vorbereitung (nicht im Video) Bereiten Sie einen frischen 1X Verdünnung von Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) in 1X PBS. Nicht mehr als 50 ml notwendig sind. Filter mit einer Spritze 0,22 um-Filter. Bereiten Injektion Konstrukte durch die Kombination von gewünschten Plasmid-Konstrukte. Wir haben alle Konstrukte in der pCAG-Flag-Vektor mit geeigneter Stöchiometrie bis zu einem Endvolumen von ~ 10 l. Außerdem sollte pCAG-GFP 14 oder pCAG-mCherry zum Verfolgen Elektro…

Discussion

Die in-ovo-Elektroporation von Embryonenküken Mittelhirn bietet eine kostengünstige und schnelle Alternative zur Erzeugung von transgenen oder Knockout-Tieren in vivo-Studie von Genfunktionen in dopaminergen Mittelhirn-Neuronen Entwicklung durchzuführen. Verwendet man die 2 mm langen L-förmigen Platinelektroden mit embryonalen Mittelhirn-spezifischen DNA-Injektion ist der Schlüssel für eine effiziente Expression des Gens von Interesse in dopaminergen Mittelhirn-Neuronen Vorläuferzellen. Darüber…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Takahiko Matsuda für die Bereitstellung der pCAG-mCherry konstruieren. YCM wird durch einen Career Development Award der Schweppe-Stiftung und ein Stipendium der Whitehall-Stiftung unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Fertilized chicken eggs Charles River Laboratories    
Egg incubator GQF Manufacturing 1502 Sportsman  
BTX Electroporator BTX Harvard Apparatus ECM830  
Electrodes BTX Harvard Apparatus 45-0162 L-shaped genetrodes For use with ECM830 electroporator
Platinum iridium wire Alfa Aesar #10056 0.5 mm diameter
For making the 2 mm long electrodes
Glass capillary tube World Precision Instrument TW100F-4  
Microloader pipette tip Eppendorf 5242 956.003  
India ink Staples   Filter 20% before use
Microinjector Parker Automation,
Parker Hannifin Cooperation
Picospritzer III  
Fluorescent dissection microscope Leica MZ16F  
Micropipette puller Sutter Instrument D-97  

References

  1. Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
  2. Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
  3. Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
  4. Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
  5. Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
  6. Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
  7. Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
  9. Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
  10. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
  11. Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  12. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  13. Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
  14. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
  15. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
  16. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).

Play Video

Cite This Article
Yang, B., Geary, L. B., Ma, Y. In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development. J. Vis. Exp. (66), e4017, doi:10.3791/4017 (2012).

View Video