In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung
Summary
Um die Funktion und die Regulation von Genen während der Entwicklung der dopaminergen Neurone im Mittelhirn zu bewerten, beschreiben wir eine Methode, die beinhaltet<em> In-ovo-</em> Elektroporation von Plasmid-DNA-Konstrukte in embryonale Küken ventralen Mittelhirn dopaminergen Neuronen Vorfahren. Diese Technik kann verwendet werden, um eine effiziente Expression von Genen des Interesses, um verschiedene Aspekte des Mittelhirns Entwicklung und Differenzierung dopaminergen Neuronen zu untersuchen.
Abstract
Dopaminergen Neuronen in der ventralen Mittelhirn Kontrolle Bewegung befindet, emotionales Verhalten und Belohnung Mechanismen 3.1. Die Dysfunktion des ventralen Mittelhirn dopaminergen Neuronen in der Parkinson-Krankheit, Schizophrenie, Depression und Demenz 5.1 verwickelt. So konnte die Untersuchung der Regulation der dopaminergen Mittelhirn-Neuronen Differenzierung nicht nur liefern wichtige Einblicke in die Mechanismen, die Mittelhirn Entwicklung und neuronale Vorläuferzellen Schicksal Spezifikation, sondern auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung einer Vielzahl von humanen neurologischen Erkrankungen.
Dopaminergen Neuronen differenzieren aus neuralen Vorläuferzellen entlang der ventrikulären Zone der embryonalen ventralen Mittelhirn. Die Entwicklung von neuralen Vorläuferzellen wird durch Genexpression 6,7 gesteuert. Hier berichten wir über Techniken der Verwendung von Elektroporation, um Gene gezielt zum Ausdruck bringen im Mittelhirn der Hamburger Hamilton (HH) Stufe 11 (thirteen Somiten, 42 Stunden) Hühnerembryonen 8,9. Die externe Entwicklung von Hühnerembryonen ermöglicht die komfortable experimentelle Manipulationen an bestimmten embryonalen Stadien, mit den Auswirkungen auf späteren Entwicklungsstadien Zeitpunkten 10-13 bestimmt. Küken embryonalen neuralen Röhren früher als HH Stadium 13 (neunzehn Somiten, 48 Stunden) bestehen aus multipotenten neuralen Vorläuferzellen zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen des Nervensystems sind. Die pCAG Vektor, der sowohl einen CMV-Promotor und ein Küken β-Actin-Enhancer enthält, kann für robuste Expression des Flag oder andere Epitop-markierten Konstrukte in Embryonenküken neuronalen Röhren 14. In diesem Bericht möchten wir betonen, besondere Maßnahmen zur regional begrenzten Gen-Expression in embryonalen dopaminergen Mittelhirn-Neuronen-Vorläuferzellen, einschließlich wie man injizieren DNA-Konstrukte gezielt in den embryonalen Mittelhirns Gegend und wie Elektroporation mit kleinen maßgeschneiderten Elektroden lokalisieren zu erreichen. Analysieren von chick Mittelhirn in späteren Stadien eine hervorragende in vivo für Plasmid-Vektor-vermittelte gain-of-Funktion und Loss-of-Funktions-Untersuchungen der Mittelhirn Entwicklung. Modifizierung des experimentellen System kann des Assays, anderen Teilen des Nervensystems erstrecken zum Durchführen Gastrula-Analyse und zur Untersuchung der Regulation der Genexpression.
Protocol
Discussion
Die in-ovo-Elektroporation von Embryonenküken Mittelhirn bietet eine kostengünstige und schnelle Alternative zur Erzeugung von transgenen oder Knockout-Tieren in vivo-Studie von Genfunktionen in dopaminergen Mittelhirn-Neuronen Entwicklung durchzuführen. Verwendet man die 2 mm langen L-förmigen Platinelektroden mit embryonalen Mittelhirn-spezifischen DNA-Injektion ist der Schlüssel für eine effiziente Expression des Gens von Interesse in dopaminergen Mittelhirn-Neuronen Vorläuferzellen. Darüber…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Takahiko Matsuda für die Bereitstellung der pCAG-mCherry konstruieren. YCM wird durch einen Career Development Award der Schweppe-Stiftung und ein Stipendium der Whitehall-Stiftung unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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