In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron
Summary
Per valutare la funzione e la regolazione dei geni durante lo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalo, si descrive un metodo che comporta<em> In ovo</emElettroporazione> di costrutti di DNA plasmidico in mesencefalo ventrale embrionali di pollo progenitori dei neuroni dopaminergici. Questa tecnica può essere utilizzata per ottenere l'espressione efficiente di geni di interesse per studiare diversi aspetti dello sviluppo e differenziamento mesencefalo neuroni dopaminergici.
Abstract
Neuroni dopaminergici situati nel movimento mesencefalo ventrale di controllo, il comportamento emozionale e meccanismi di ricompensa 1-3. La disfunzione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale è implicata nella malattia di Parkinson, la schizofrenia, la depressione e la demenza 1-5. Così, studiando la regolazione della differenziazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo non ha potuto fornire solo informazioni importanti meccanismi che regolano lo sviluppo mesencefalo e il destino progenitrici neurali specifiche, ma anche contribuire a sviluppare nuove strategie terapeutiche per il trattamento di una varietà di malattie neurologiche umane.
Neuroni dopaminergici differenziarsi dai progenitori neurali che rivestono la zona ventricolare del embrionale mesencefalo ventrale. Lo sviluppo di progenitori neurali è controllato da programmi di espressione genetica 6,7. Qui segnaliamo che utilizzano tecniche di elettroporazione ad esprimere geni in particolare nel mesencefalo di Hamburger Hamilton (HH) stadio 11 (thsomiti irteen, 42 ore) 8,9 embrioni di pollo. Lo sviluppo degli embrioni di pollo esterna consente una comoda manipolazioni sperimentali in specifiche fasi embrionali, con gli effetti determinati in tempi successivi di sviluppo 10-13. Chick tubi embrionali neuronali precedenti alla fase di HH 13 (diciannove somiti, 48 ore) sono costituiti da multipotenti progenitori neurali che sono in grado di differenziarsi in diversi tipi di cellule del sistema nervoso. Il vettore pCAG, che contiene sia un promotore CMV e un pulcino β-actina enhancer, permette l'espressione solida di bandiera o di altri costrutti epitopo-tag in tubi neurali embrionali di pollo 14. In questa relazione, vogliamo sottolineare misure speciali per realizzare l'espressione genica regionalmente limitato embrionali progenitori dei neuroni dopaminergici del mesencefalo, tra cui come iniettare DNA costruisce in particolare nella regione del mesencefalo embrionale e come individuare elettroporazione con piccoli elettrodi di misura. Analisi cmesencefalo Hick nelle fasi successive fornisce un ottimo sistema di vivo per vettore plasmidico-mediata guadagno di funzione e la perdita di funzione studi di sviluppo mesencefalo. Modifica del sistema sperimentale può estendere il saggio in altre parti del sistema nervoso per eseguire la mappatura analisi destino e per indagare la regolazione dell'espressione genica.
Protocol
Discussion
L'elettroporazione in ovo di mesencefalo pulcino embrionale offre un basso costo e rapida alternativa alla generazione di animali transgenici o knockout per eseguire studio in vivo delle funzioni geniche in sviluppo mesencefalo dopaminergica neurone. Uso breve 2 millimetri elettrodi di platino lunghezza L-forma insieme embrionale mesencefalo-specifica iniezione del DNA è la chiave per ottenere l'espressione efficiente del gene di interesse in mesencefalo progenitori neuroni dopaminergici. Inol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Takahiko Matsuda per la fornitura del pCAG-mCherry costruire. YCM è supportata da un Career Development Award da parte della Fondazione Schweppe e una sovvenzione dalla Fondazione Whitehall.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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