Para evaluar la función y la regulación de los genes durante el desarrollo de las neuronas del cerebro medio dopaminérgico, se describe un método que consiste en<em> In ovo</em> Electroporación de construcciones de ADN plásmido en células progenitoras embrionarias de pollo ventral del cerebro medio de neuronas dopaminérgicas. Esta técnica puede utilizarse para lograr la expresión eficiente de genes de interés para estudiar diferentes aspectos del desarrollo y diferenciación de las neuronas del mesencéfalo dopaminérgica.
Las neuronas dopaminérgicas en el movimiento del mesencéfalo ventral de control, el comportamiento emocional y los mecanismos de recompensa 1-3. La disfunción de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral, está implicado en la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia, la depresión y la demencia 1-5. De este modo, el estudio de la regulación de la diferenciación de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, no sólo podría proporcionar información importante sobre los mecanismos que regulan el desarrollo del cerebro medio y la especificación progenitoras neurales destino, sino también ayudar a desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de una variedad de trastornos neurológicos humanos.
Las neuronas dopaminérgicas diferenciarse de progenitores neurales que recubren la zona ventricular del cerebro medio ventral embrionario. El desarrollo de progenitores neurales está controlado por programas de expresión génica 6,7. Aquí mostramos las técnicas que utilizan la electroporación para expresar los genes específicamente en el cerebro medio de Hamburger y Hamilton (HH) la 11 ª etapa (tsomitas irteen, 42 horas), los embriones de pollo 8,9. El desarrollo de embriones de pollo externa permite convenientes manipulaciones experimentales en determinadas etapas embrionarias, con los efectos determinados en los puntos de tiempo posteriores del desarrollo 10-13. Polluelo de tubos neurales embrionarias antes del estadio HH 13 (diecinueve somitas, 48 horas) consistirá en multipotenciales progenitoras neuronales que son capaces de diferenciarse en distintos tipos de células del sistema nervioso. El vector pCAG, que contiene tanto un promotor de CMV y un polluelo β-actina potenciador, permite la expresión robusta de la bandera o otras construcciones etiquetados epítopo en tubos de embriones de pollo neural 14. En este informe, hacemos hincapié en las medidas especiales para lograr la expresión de genes regional restringido en mesencéfalo dopaminérgicas embrionarias progenitoras neuronales, incluyendo cómo inyectar ADN construye específicamente en la región del cerebro medio embrionario y cómo identificar electroporación con pequeños electrodos hechos a la medida. El análisis de ccerebro medio cateto en etapas posteriores ofrece un excelente sistema in vivo para el plásmido vector-mediado por el aumento de la función y la pérdida de la función de los estudios del desarrollo del cerebro medio. La modificación del sistema experimental puede extender el ensayo a otras partes del sistema nervioso para realizar análisis destino mapeo y para investigar la regulación de la expresión génica.
La electroporación in ovo en el cerebro medio de los embriones de pollo ofrece una alternativa de bajo costo y rápida a la generación de animales transgénicos o knockout para realizar el estudio in vivo de las funciones de los genes en el cerebro medio dopaminérgico el desarrollo neuronal. Usando corto 2 mm de electrodos de platino largos en forma de L, junto con la inyección de ADN embrionario mesencéfalo-específico es la clave para lograr una expresión eficaz del gen de interés en …
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Dr. Takahiko Matsuda para la prestación del pCAG-mCherry construir. YCM está respaldada por un premio de Desarrollo de la Carrera de la Fundación Schweppe y una beca de la Fundación Whitehall.
Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
India ink | Staples | Filter 20% before use | |
Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |