Summary
I den post-genomik eran är tillgången av rekombinanta proteiner i nativa konformationer avgörande för strukturella, funktionella och terapeutisk forskning och utveckling. Här beskriver vi ett test-och storskaliga proteinuttryck system i humana embryonala njurceller 293T som kan användas för att tillverka en mängd olika rekombinanta proteiner.
Abstract
Rekombinant proteinuttryck i bakterier, typiskt E. coli, har varit den mest framgångsrika strategin för milligram mängden uttryck av proteiner. Emellertid prokaryota värdar är ofta inte lika lämpliga för uttryck av humana, virala eller eukaryota proteiner på grund av toxiciteten hos det främmande makromolekyl, skillnader i proteinets veckning maskinen, eller på grund av avsaknaden av särskilda co-eller post-translationella modifieringar i bakterier. Expressionssystem baserade på jäst (P. pastoris eller S. cerevisiae) 1,2, bakulovirus-infekterade insektsceller (S. frugiperda eller T. ni) celler 3, och cellfria in vitro-translation system 2,4 har med framgång använts för att producera däggdjursproteiner. Intuitivt, är den bästa matchningen att använda en däggdjursvärd för att säkerställa produktion av rekombinanta proteiner som innehåller de korrekta posttranslationella modifieringar. Ett antal däggdjurscellinjer (Humana embryonala KidNey (HEK) 293, har C V-1-celler i O rigin bär S V40 larget T-antigen (COS), kinesisk hamsterovarie (CHO), och andra) har med framgång används för att överuttrycka milligrammängder av ett antal humana proteiner 5-9. Emellertid är fördelarna med att använda däggdjursceller ofta motverkas av högre kostnader, krav på speciell laboratorieutrustning, lägre utbyten protein, och de långa för att utveckla stabila linjer expressionssystem cell. Ökad avkastning och producerar proteiner snabbare, samtidigt som kostnaderna hålls låga, är viktiga faktorer för många akademiska och kommersiella laboratorier.
Här beskriver vi ett tids-och kostnadseffektiv, två delar förfarande för uttrycket av utsöndrade humana proteiner från fastsittande HEK 293T-celler. Detta system är kapabel att producera mikrogram till milligrammängder av funktionellt protein för strukturella, biofysikaliska och biokemiska studier. Den första delen, flera konstruktioner av genen av intresse är gerd parallellt och övergående till vidhäftande HEK 293T-celler i liten skala. Detektering och analys av rekombinant protein som utsöndras i cellodlingsmediet utförs genom western blot-analys med användning av kommersiellt tillgängliga antikroppar riktade mot en vektor-kodade proteinet rening tagg. Därefter lämpliga konstruktioner för storskalig proteinproduktion transfekterades transient med användning polyetylenimin (PEI) i 10-skikt cellfabriker. Proteiner utsöndrade in liters-volymer av konditionerat medium koncentreras till hanterbara mängder med användning tangentiell flödesfiltrering, följt av rening av anti-HA-affinitetskromatografi. Användbarheten av denna plattform bevisas av dess förmåga att uttrycka milligrammängder av cytokiner, cytokinreceptorer, cellytreceptorer och inneboende faktorer restriktionsställen och virala glykoproteiner. Denna metod har också framgångsrikt använts vid strukturell bestämning av de trimera 5,10 ebolavirus glykoprotein.
CO2-inkubator, som krävs. Detta förfarande kan snabbt utökas till system med större komplexitet, till exempel sam-expression av proteinkomplex, antigener och antikroppar, produktion av virusliknande partiklar för vacciner, eller produktion av adenovirus eller lentivirus för transduktion svåra cellinjer.
Protocol
1. Förberedelser - Konstruerar och cellodlingar
Före start av protokollet bör genen av intresse vara kodon-optimerad för uttryck i däggdjursceller, och klonas in i en lämplig uttrycksvektor med användning av standardmässiga molekylärbiologiska tekniker. För att säkerställa den högsta risken för framgångsrik expression bör multipla varianter av genen av intresse kan genereras. Många däggdjursexpressionsvektorer är kommersiellt tillgängliga och har olika reningsförfaranden taggar (polyhistidin, hemagglutinin, streptavidin, halo-Tag, glutation S-transferas, bland andra). Vi föredrar att använda pDISPLAY vektorn, som kodar för en stark humant cytomegalovirus-promotor, en Ig-κ utsöndringssignal, hemagglutinin märkningen för rening, och har en C-terminal transmembranankare för att rikta proteinet genom den sekretoriska vägen för visning på plasmamembranet. Vi in vanligtvis en stoppkodon i främre delen av vektor-kodade transmembran anchor för att tillåta proteinet att utsöndras i det konditionerade mediet.
Humana embryonala njurceller (HEK) 293 T-celler är allmänt tillgängliga och kan lätt odlas och transfekteras. HEK 293T används rutinmässigt för uttryck av däggdjursproteiner, men anses biologiskt och bör hanteras på skyddsnivå 2. Vänligen använd lämplig personlig skyddsutrustning, arbetet ska utföras i en godkänd biosäkerhet skåp med aseptisk teknik. Allt avfall och ytor bör desinficeras i enlighet med institutionella och statliga riktlinjer. Det rekommenderas att celler testas med avseende på mykoplasma kontaminering före användning. Cellerna kan behandlas med ciprofloxacin (10 | ig / ml) under tio dagar för att utrota vilken källa som helst av mykoplasma spp. kontaminering. Allmänna protokoll för att sprida HEK 293T-celler presenteras separat (ruta 1).
Ytterligare överväganden för test-och storskaliga proteinuttryck är reviewedi 11-15.
2. Småskalig Test uttryck
När konstruktioner har utformats och genererade, småskaliga tester transfektioner kan utföras med HEK 293T-celler, en schematisk sammanfattning processen presenteras nedan (Fig. 1).
- Använd T75 cm 2 eller T225 cm 2 cell kolvar kultur (beroende på antalet prov uttryck som skall utföras) att odla HEK 293T-celler och dela cellerna var 2-3 dagar när cellerna är 100% konfluenta (Box 1).
- Frö 2,5 x 10 5 HEK 293T-celler per brunn i en 6-brunnsplatta och tillsätt 2 ml DMEM med 1 x pen / strep och 10% (volym / volym) FBS, vändes plattan försiktigt för att säkerställa jämn cellen finfördelning i varje brunn, och inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad kammare.
- När HEK 293T-celler når 40% konfluens, kassera media och tillsätt färsk 2 ml DMEM med 1 x pen / strep och 10% (volym / volym) FBS till brunnarna. Utföratransfektionsanalyser.
- Alikvot 90 pl serumfritt DMEM till en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör. Pipetten 3 pl GeneJuice i serumfritt DMEM och blanda försiktigt röret (fingret virvel). Inkubera under 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 1 pg av MiniPrep renat plasmid-DNA (DNA-lager = 100 ng / ^ il) i DMEM-GeneJuice blandning, finger virvling och inkuberas under 15 minuter vid rumstemperatur.
- Pipettera den droppvisa transfektion blandningen på HEK 293T-celler, och snurrar 6-brunnsplatta försiktigt för att tillåta jämn fördelning av transfektionsblandningen. Inkubera 6-brunnars platta vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad kammare.
- Tillsätt 1 ml färskt DMEM med 1 x pen / strep och 10% (volym / volym) FBS till varje brunn 24 h efter transfektion och inkubera under ytterligare 48 timmar (totalt 72 timmar).
- Skörd 1 ml av supernatanten från varje brunn vid tre dagar efter transfektion och mikrocentrifug proverna vid 16.000 g under 10 minuter vid rumstemperatur. Utför Western blot-analys som beskrivs i ruta 2. Prover kan lagras vid 4 ° C. Längden av lagring vid 4 ° C är protein-beroende.
3. Storskalig Test Expression och rening
När väl en konstruktion har identifierats mg kvantitet expression av rekombinant protein uppnås genom PEI transfektion av HEK vidhäftande 293T-celler med användning 10-skikt cellfabriker (fig. 2; 6360 cm 2 ytarea). För mer undersökande studier, kan mindre cellfabriker eller T-kolvar (tabell 1) användas.
- Rena 1 mg DNA för transfektion med hjälp av en Maxiprep plasmidrening kit. En 500 ml odling över natten av XL-1 Blue-celler bör ge åtminstone 1 mg av rent DNA. Kontrollera renheten hos DNA genom att mäta en 260 / A-förhållande 280; bör vara över 1,8.
- Skala upp HEK 293T-celler till 2,0 X 10 8-celler. Varje T225 cm 2 kolv vuxit till 100% sammanflytning samarbetentains och genomsnittliga av ~ 2,25 x 10 7 celler.
- Tillsätt 1,2 L DMEM med 5% (volym / volym) FBS till en 10-skikt cellfabrik. Tillsätt 2,0 x 10 8 HEK 293T-celler till cellen fabriken och fördela celler jämnt till alla skikt i kärlet. Det är mycket svårt att visualisera konfluens av celler i cellfabrik. Som ett alternativ, inrättat en T75 cm 2-kolv med ett lämpligt antal celler, med användning av samma cellantal till ytarea som utfördes med 10-skiktet kärlet. Övervaka detta kolv för tillväxt. Se tillhörande video för instruktioner om hantering av cellfabriken. Inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO2 för att möjliggöra cellvidhäftning och tillväxt.
- Utför stora transfektion då fastsittande HEK 293T-celler är 70% sammanflytande. Framställa PEI-DNA-transfektion blandning (3:1 vikt / vikt PEI till DNA-förhållande) i en biosäkerhet skåp med en steril T75 cm 2 kolv. Blanda 0,84 mg DNA med 84 ml steril 1 X PBS, tillsätt sedan 2,5 ml av PEI (2.5 mg totalt PEI). Inkubera vid rumstemperatur under 15 minuter. Lösningen bör vara grumlig.
- Hälla den PEI-DNA-transfektion blandningen långsamt in i cellen fabriken och grundligt fördela över alla skikt i kärlet. Tillval: för ökad expression avkastning, tillsätt valproinsyra (4 mM slutlig koncentration). Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 under fyra dagar.
- Skörd överstående fyra dagar efter transfektion. Centrifugera det konditionerade mediet vid 6000 x g under 30 minuter vid 4 ° C. Ytterligare filtrera supernatanten med användning av en 0,22 | im Stericup vakuumfilter apparat. Den 10-lagret cellfabriken kan återanvändas, se ruta 3 för rengöring instruktioner. Det är nyckeln som städning påbörjas omedelbart efter supernatanten skörden, låt inte de celler torka på fartyget ytan.
- Koncentrera supernatanten till 75 ml genom användning av Centramate tangentiellt flöde filtrering.
- Tillsätt 500 ml PBS och re-koncentrat till 75 ml. Upprepa tre Additional gånger för att fullständigt buffertbyte provet.
- Jämvikta en 1 ml anti-HA-affinitetskolonn med 1 x PBS och applicera koncentrerade provet med hjälp av tyngdkraften strömma med en hastighet <1 ml / min.
- Tvätta kolonnen med 30 ml 1 x PBS-Tween 20.
- Lös HA-peptid i 1 X PBS (1,0 mg / ml) och inkubera vid 37 ° C.
- Tillämpas 1 ml av HA-peptiden till anti-HA-kolonnen och peptiden att strömma in i hartset. Samla flödet genom. Stoppa flödet när peptiden lösningen når bäddens höjd.
- Inkubera det hela anti-HA-kolonn vid 37 ° C under 15 minuter.
- Upprepa steg 12 två extra gånger.
- Tillämpas 1 ml 1X PBS till anti-HA-kolonn och flöde in i hartset tills den når bäddens höjd. Samla flödet genom.
- Regenerera anti-HA-kolonnen med 10 ml 0,1 M glycin pH 2,2. Tvätta med 10 ml PBS och lagra affinitetskolonn vid 4 ° C i PBS med 0,02% (vikt / volym) NaNs 3.
- Utför SDS-PAGE analys och pool fractions därefter. Obs: HA-peptiden kommer att störa mätningar protein koncentration av A 280 eller Bradford. Att uppskatta den mängd protein som föreligger, belastning 5, 10, 15, 25 ^ g BSA på SDS-PAGE-gel som en standard och jämföra bandintensiteter.
Steg 9-17 kan upprepas för att fånga ytterligare protein från det konditionerade mediet.
4. Representativa resultat
I den här artikeln beskriver vi och visa ett praktiskt uttryck plattform för milligram-mängden produktion av humana proteiner som sedan kan användas för strukturella och funktionella studier. Granskningen av humana proteinet konstruktioner med HEK 293T-celler i 6-brunnar är effektiv och effektiv i att identifiera konstruktioner som lämpar sig för storskalig produktion. Kommersiella expressionsvektorer kan transfekteras effektivt i HEK 293T-celler med hjälp av olika transfektionstekniker reagens, såsom GeneJuice, Fugene HD eller PE I. Vi rekommenderar användning av ett kommersiellt transfektion reagens, såsom GeneJuice eller Fugene HD, för test uttryck, eftersom dessa reagenser är mer effektiva för fattigare uttrycker proteiner (Fig. 3). Konstruktioner som väljs ut för större skala uttryck bör präglas av en enda, stark intensitet band, vilket motsvarar rätt molekylvikten på den västra blot (Fig. 3). Glykoproteiner kan migrera till en bredare bandet på grund av heterogenitet i glykosylering. Vi har visat att en mängd olika makromolekyler, som sträcker sig från virala glykoproteiner, cytokiner, cytokinreceptorer, och andra proteiner på ytan, kan uttryckas och renas för att ge millgram mängder protein med användning av denna allmänna uttrycket plattformen (figur 4).
Figur 1. Arbetsflöde schematisk småskaliga transfektioner.tp_upload/4041/4041fig1large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Corning 10-lagret CellSTACK för en större skala proteinuttryck. Varje lager innehåller 636 cm 2 yta för cellbindning. En standard laboratorium CO 2-inkubator (6,0 cu. Fot) kommer att bekvämt hålla fyra 10-lager cellfabriker.
.. Figur 3 Småskalig uttryck för olika utsöndrade proteiner Vi gjorde en serie småskaliga tester uttryck med hjälp av gemensamma transfektion reagens. GeneJuice, Fugene HD och PEI (a) Western blot screening av utvalda humana cellulära proteiner (tetherin), receptorer (IL-2R β subenheten) och cytokiner (IL-2). Tetherin är en människa membranglykoprotein som begränsar frisättningen avframväxande HIV-1-virioner 16. Den extracellulära domänen av tetherin existerar som en glykosylerad, disulfidbunden dimer av ~ 36 kDa. Under reducerande betingelser, såsom visas här, migrerar tetherin som en monomer med en skenbar molekylvikt av ~ 22 kDa. Interleukin-2 (IL-2) är en cytokin (~ 17 kDa) som ingår i lymfocytproliferation 17. Den samverkar med den IL-2-receptorkomplexet, av vilka IL-2R βsubunit (~ 26 kDa) är en komponent 18. CD21 är ett membranprotein som deltar i aktivering och mognad B-celler genom komplementsystemet, och är också en receptor för Epstein-Barr-virus. Den glykosylerade extracellulära domänen av CD21 migrerar som en monomer med en skenbar molekylvikt av ~ 20 kDa. (B) Western-blot screening av utvalda ytaktiva virala glykoproteiner (XMRV Env och ebolavirus GP). XMRV och ebolavirus glykoproteiner (transmembranankare utgår) finns på det virala membranet som trimera spikar och är involverade i värdcellen bilagaoch fusion. Ektodomänen hos XMRV Env och EBOV GP är kraftigt dekorerad med N-kopplade glykaner och migrera till skenbara molekylvikter av 70 kDa och 75 kDa, respektive.
Figur 4. Renade humana cellulära proteiner från storskaliga HEK 293T kulturer. Alla proteiner uttrycktes med användning av en 10-skikt cellfabrik och koncentrerades och renades genom anti-HA-kromatografi. Såsom visas genom Coomassie-färgad SDS-PAGE-analys, de extracellulära domänerna av interleukin-2-receptorn (IL-2R) α och γ subenheter migrera vid molekylvikter av 40 kDa och 46 kDa, respektive. Den extracellulära domänen av tetherin migrerar som en dimer, under icke-reducerande betingelser, med en skenbar molekylvikt av 36 kDa. Notera att det finns viss kontamination BSA som visas vid en skenbar molekylvikt av 60 kDa. Dessutom heterogenitet N-länkade glykaner finns på tetherin,IL-2R α och IL-2R γ orsaker bandbreddning på SDS-PAGE-gel. Dessa komplex-typ N-länkade glykaner kan avlägsnas med användning av peptid: N-glykosidas F.
| Fartyg | Ytarea |
| 6-brunnars platta | 9,5 cm 2 (vardera brunn) |
| 100 mm skålar | 55 cm 2 |
| 245 mm skålar | 500 cm 2 |
| T75 cm 2 kolv | 75 cm 2 |
| T175 cm 2 kolv | 175 cm 2 |
| T225 cm 2 kolv | 225 cm 2 |
| Roller flaska regelbunden | 850 cm 2 |
| Roller flaska utökad yta | 1700 cm 2 |
| 1-skiktet CellSTACK | 636 cm 2 |
| 2-skikt CellSTACK | 1272 cm 2 |
| 5-skikt CellSTACK | 3180 cm 2 |
| 10-skikt CellSTACK | 6360 cm 2 |
| 40-skikt CellSTACK | 25.440 cm 2 |
Tabell 1. Jämförelse av kärl för cellodling används för proteinuttryck.
Lista över Reagens Recept
100X Ciprofloxacine För 10 ml, tillsätt 10 ml avjoniserat vatten till 10 mg ciprofloxacin. Tillsätt 10 pl 6 N HCl för att fullständigt lösa ciprofloxacin.
PEI (1 mg / ml) För en 100 ml lösning, löses 100 mg av 25 kDa linjär PEI i avjoniserat vatten och värm till 80 ° C. Kyler lösningen till rumstemperatur, justera pH till 7,2, 0,22 ^ m filter sterilisera, alikvot och frys vid -20 ° C under long-tids lagring.
1X PBS under 1 L vatten: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na 2 HPO4 (vattenfritt), 0,24 g KH 2 PO 4. Justera lösningens pH till 7,4 och fyll till 1,0 L.
1 X PBS-Tween-20 för en L vattenhaltig lösning: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na 2 HPO4 (vattenfritt), 0,24 g KH 2 PO 4, 1 ml Tween-20. Justera lösningens pH till 7,4 och fyll till 1,0 L.
1X överföringsbuffert under 1 L vatten: 3,0 g Tris-bas, 14,4 g glycin, 150 ml metanol.
1X SDS-PAGE kömingsbuffert För 1 L vattenlösning: 3,0 g Tris-bas, 14,4 g glycin, 1,0 g SDS.
SDS-PAGE-reducerande provbuffert för 10 ml lösning: 0,6 g SDS, 3 ml glycerol, 1,8 ml 1,0 Tris-HCl pH 6,8, 1 mg bromfenolblått, 5% (volym / volym) 2-merkaptoetanol.
- Växa HEK 293T-celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS), 1 X pen / strep vid 37 ° C i en 5% CO2-fuktad atmosfär.
- Observera celler under ett inverterat mikroskop. När celler är 100% konfluens, ta bort och kasta odlingsmedium.
- Skölj-celler med 5 ml steril 1 x PBS för att avlägsna spår av serum. Kassera PBS tvätt.
- Tillsätt 2 ml av 0,05% (vikt / vol) trypsin-EDTA-lösning till en T225 cm 2 kolv (eller 1 ml av 0,05% (vikt / vol) trypsin-EDTA under T75 cm 2 kolv) och inkubera vid rumstemperatur tills cellerna lossnar från ytan. Det är även möjligt att använda steril 1 x PBS-EDTA för att frigöra HEK 293T-celler.
- Tillsätt 13 ml DMEM med 10% (volym / volym) FBS till en T225 cm 2 kolv (eller 9 ml DMEM med 10% (volym / volym) FBS under T75 cm 2 kolv) att inhibera trypsin reaktionen.
- Delas calnar 1:5. För en T225 cm 2, tillsätt 3 ml cellsuspension till 27 ml färskt DMEM med 1X pen / strep och 10% (volym / volym) FBS i en ny odlingskärlet. För en T75 cm 2, tillsätt 2 ml cellsuspension till 8 ml färskt tillväxtmedium. Inkubera kulturer vid 37 ° C i en 5% CO2-fuktad atmosfär. Cellerna ska växa till 100% sammanflytning inom två dagar.
Ruta 2. Western blot-analys
- Tillsätt 10 pl SDS-PAGE-reducerande provbuffert till 30 | il cellkultursupernatant. Belastning prover och förfärgade molekylviktsmarkörer på polyakrylamidgeler och elektrofores med användning 1X SDS-PAGE-rinnande buffert vid 175 V under 1 timme eller tills molekylviktsmarkörer är väl lösts.
- Blötlägg PVDF membranet Immobilon-P i 100% metanol under 1 minut för att aktivera.
- Montera western blot-apparat. Se PVDF-membranet är vänd mot den positiva elektroden och hålla alla komponenter våta med 1 x överföringsbuffert. Avoid bubblor mellan polyakrylamidgel och membranet.
- Fullständigt fylla elektroforeskammare med 1 x överföringsbuffert och överföring under 1 timme vid 100 V.
- Blockera membranet med 5% (vikt / volym) skummjölk i 1 x PBS-Tween 20 under 1 timme vid rumstemperatur, eller över natten vid 4 ° C.
- Inkubera med monoklonal primär antikropp (dvs. 1:1000 utspädning anti-HA mAb eller annan lämplig antikropp) upplöst i 5% (vikt / volym) skummjölk i 1 x PBS-Tween 20 under 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Tvätta membranen i 1 x PBS-Tween 20 under 10 minuter. Upprepa två extra gånger.
- Inkubera med en monoklonal sekundär antikropp konjugerad med alkaliskt fosfatas (1:1000 utspädning i 5% (vikt / volym) skummjölk i 1 x PBS-Tween 20) under 1 timme vid rumstemperatur, eller över natten vid 4 ° C.
- Tvätta membranen i 1 x PBS-Tween 20 under 10 minuter. Upprepa två extra gånger.
- Placera membranet i en liten behållare, tillsätt 5 ml alkalisk fosfatas substrate (BCIP / NBT)-lösning. Färgutvecklingen bör ske inom 1-5 minuter. När önskade bandet intensiteten nås, tvätta med avjoniserat vatten och lufttorka. Färg kan blekna med tiden, elektroniskt scanna membranen gång torra.
Ruta 3. Rengöring och återvinning av fartyg cellkulturer
Medan cellfabriker är utformade för att vara singel användning kan dessa fartyg återvinnas för ytterligare storskaliga transfektioner med hjälp av följande städning protokoll:
- Omedelbart efter dekantering av supernatanten från det 10-skiktet cellfabrik, tillsätt 20% (volym / volym) blekmedel och skaka kraftigt för att frigöra celler. Inkubera vid rumstemperatur under tre timmar.
- Tömma kärlet och tillsätt färsk 20% (volym / volym) blekmedel och inkubera vid rumstemperatur över natten.
- Tömma kärlet och tvätta med 1,5 I avjoniserat vatten. Upprepa tre gånger.
- Tömma 10-skiktet cellfabrik och tillsätt 0,5 L sterilt 1X PBS kompletterad med 10X antibiotisk / antimykotisk lösning. Förvara kärlet vid rumstemperatur och byt ventilering lock för att fylla portar (standard 33 mm gängad caps) före nästa användning. Obs: alla lager ska vara helt klart efter rengöring, om inte, använd inte och avyttra cellfabriken enligt lokala riktlinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 10-skikt cellfabriker är en effektiv kärl för produktion av milligrammängder av proteinet. En stor fördel med att använda cellfabrik framför andra traditionella kärl, såsom rullflaskor, kolvar skaka eller spinnkolvar, är att de inte kräver att köpa ytterligare laboratorieutrustning. En standard CO 2-inkubator (ca 6,0 cu. Fot) kommer lätt rymma fyra 10-lagers cellfabriker (Fig. 2). Dessutom är dessa kärl kräver mindre arbetskraft och utrymme än skålar, flaskor eller rullflaskor för att producera celler och proteiner; en 10-skikt cellfabrik är likvärdiga med användning av 7,5 regelbundna rullflaskor (tabell 1). Ännu viktigare är att HEK 293T-celler anpassa sig väl i kärlen och är mycket mottagliga för transient transfektion av PEI, vilket ger en låg kostnad och effektivt alternativ till kommersiella transfektion reagens. Medan cellfabriker är utformade för att vara av engångstyp cellodling plastvaror, har vi Been effektivt kunna rengöra och återanvända dessa fartyg flera gånger utan kontaminering frågor, och därigenom minskar dess kostnad per användning. Övergående proteinuttryck med användning av en 10-skikt cellfabrik har förmåga att producera ~ 1-10 mg renat protein (fig 4), beroende på proteinet och dess modifieringar. Det är möjligt att gå från kloning och småskaliga uttryck till fullbordandet av storskalig expression och rening av ca 3-4 veckor. Sammanfattningsvis är detta en snabb, allmän plattform som är mycket användbar vid produktion av utsöndrade humana eller virala ytproteiner. Dessutom kan denna plattform också användas för att uttrycka antikroppar, virusliknande partiklar, och adenovirus och lentivirus för genöverföring.
Vi har nedan vanliga problem och möjliga lösningar. För en mer detaljerad felsökningsguide, se 14.
- Ingen eller mycket låg protein uttryck:
- Dålig hälsa av cellerna-Färga cellerna med användning av Trypan blå för viabilitet och test för mykoplasmkontaminering. Om celler har en hög passage antal (> 25 passager) och växer långsamt, börja om på nytt med nya HEK 293T-celler. Transfektionseffektivitet och proteinproduktion påverkas av en ålder av cellerna i kulturen.
- Dåliga övergående transfektion-Cells bör transfekteras på en konfluens nivå av 40%. Förhållandena av DNA för transfektion reagens bör optimeras.
- Proteinet är instabilt eller inte vikas-Kontrollera cellpelleten för olösligt protein. Testa uttryck för andra konstruktioner eller homologa protein.
- Inget protein elueras från kolonnen:
- Protein kvar i kolonnen, eluering av proteinet av intresse med 0,1 M glycin pH 2,2 och analysera genom western blöt. Om proteinet kvarhålles använder en högre koncentration av syntetisk HA-peptid för eluering eller inkubera kolonnen vid 37 ° C under längre perioder.
- anti-HA column skadas-Medan kolonnen, om rengöras och lagras på rätt sätt, kan återanvändas flera gånger, kommer effektiviteten hos kolonnen minska med tiden. Använd en ny anti-HA-kolonn.
- Proteinnedbrytning-tillsätta proteasinhibitorer och hålla proteinet på is under hela reningsprocessen.
- Proteinet har utfällas eller aggregeras på kolonn-Om proteinet är instabil, prova olika konstruktioner eller tillstånd buffert (dvs. pH, salter, tillsatser etc.) för att förbättra proteinstabilitet.
- Protein inte att binda till kolumn-De kan HA-tag grävas ned eller obefintliga. Kontrollera att proteinet inte är i genomflödet eller tvättar.
- Serumalbumin förorening:
Bovint serumalbumin (BSA) tenderar att binda icke-specifikt till den anti-HA-harts och kan förorena de HA-peptid elueringar. I Fig.. 4, migrerar BSA som en kompakt band vid en skenbar molekylvikt av ~ 60-65 kDa. I detta fall ökar Tween-20 koncentration i 1 X PBS-Tween20 tvätt med 0,2% (volym / volym) och öka volymen av tvätten. Alternativt kan BSA kontaminering avlägsnas med användning av storleksuteslutningskromatografi eller jonbyteskromatografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Ontario hiv-behandling Network Research driftsbidrag (ROG-G645) och kanadensiska Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113.554) för att JEL och University of Toronto stipendier till HA, FCA, och JDC. Författarna vill tacka Marnie Fusco, Dafna Abelson och Dr Erica Ollmann Saphire på The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) för att ge celler, ebolavirus GP expressionsvektor och allmänna råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0x10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab')2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
