Summary
I den post-humane genom-æraen, er tilgængeligheden af rekombinante proteiner i native konformationer afgørende for strukturel, funktionel og terapeutisk forskning og udvikling. Her beskriver vi en test-og store protein-ekspressionssystem i humane embryoniske nyre 293T-celler, som kan anvendes til fremstilling af en række af rekombinante proteiner.
Abstract
Rekombinant protein ekspression i bakterier, typisk E. coli, har været den mest succesfulde strategi for milligram mængde ekspression af proteiner. Imidlertid prokaryote værter er ofte ikke så egnet til ekspression af humane, virale eller eukaryote proteiner på grund af toksicitet af det fremmede makromolekylet, forskelle i proteinfoldning maskinen eller på grund af manglen på bestemte co-eller post-translationelle modifikationer i bakterier. Ekspressionssystemer baseret på gær (P. pastoris eller S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-inficerede insektceller (S. frugiperda eller T. ni) celler 3, og cellefri translation in vitro systemer 2,4 succes er blevet anvendt til at producerer mammale proteiner. Intuitivt det bedste match er at anvende en mammal vært til at sikre produktionen af rekombinante proteiner, der indeholder de korrekte post-translationelle modifikationer. Et antal pattedyrscellelinier (Human Embryonic børneney (HEK) 293, er C V-1-celler i O rigin bærer S V40 indikativpris T-antigen (COS), kinesisk hamsterovarie (CHO), og andre) er blevet anvendt med succes til at overudtrykke milligram-mængder af en række humane proteiner 5-9. Imidlertid er fordelene ved at bruge pattedyrceller imødegås ofte med højere omkostninger, krav om specialiseret laboratorieudstyr, lavere protein udbytter, og lange gange for at udvikle stabile udtryk cellelinjer. Øget udbytte og producerer proteiner hurtigere, og samtidig holde omkostningerne nede, er vigtige faktorer for mange akademiske og kommercielle laboratorier.
Her beskriver vi en tids-og omkostningseffektiv, todelt fremgangsmåde til ekspression af secernerede humane proteiner fra adhærente HEK 293T-celler. Dette system er i stand til at frembringe mikrogram til milligram-mængder af funktionelt protein for strukturelle, biofysiske og biokemiske undersøgelser. Den første del, multiple konstruktioner af genet af interesse er producered parallelt og forbigående transficeret ind i omliggende HEK-293T celler i lille skala. Påvisning og analyse af rekombinant protein secerneret i cellekulturmediet udføres ved western blot-analyse under anvendelse af kommercielt tilgængelige antistoffer rettet mod en vektor-kodede protein rensnings-taggen. Efterfølgende egnede konstruktioner til proteinproduktion i stor skala produktion transient transficeret med polyethylenimin (PEI) i 10 lag cellefabrikker. Proteiner udskilt i l-volumener af konditioneret medium er koncentreret i håndterbare størrelse ved hjælp af tangentielstrømningsfiltrering, efterfulgt af oprensning af anti-HA-affinitetskromatografi. Anvendeligheden af denne platform påvises ved dets evne til at udtrykke milligram-mængder af cytokiner, cytokin-receptorer, celleoverfladereceptorer, iboende begrænsninger faktorer og virale glycoproteiner. Denne fremgangsmåde blev også med held anvendt i strukturel bestemmelse af de trimere ebolavirus glycoprotein 5,10.
CO2-inkubator, der kræves. Denne procedure kan hurtigt udvides til systemer med større kompleksitet, såsom co-ekspression af protein-komplekser, antigener og antistoffer, fremstillingen af viruslignende partikler til vacciner, eller produktion af adenovira eller lentivira til transduktion af vanskelige cellelinier.
Protocol
1. Forberedende arbejde - konstruktioner og cellekulturer
Før start protokollen skal genet af interesse være kodon-optimeret til ekspression i pattedyrceller, og klonet ind i en passende ekspressionsvektor ved anvendelse af standard molekylærbiologiske teknikker. For at sikre den højeste chance for vellykket ekspression bør multiple varianter af genet af interesse blive genereret. Mange mammale ekspressionsvektorer er kommercielt tilgængelige og har forskellige oprensningsmetoder tags (polyhistidin, hemagglutinin, streptavidin, halogen-Tag, glutathion S-transferase, blandt andre). Vi foretrækker at anvende pDISPLAY vektoren, som koder for en stærk human cytomegaloviruspromotor, en Ig κ sekretionssignal, hemagglutinin rensnings-taggen, og har en C-terminal transmembrane anker til at målrette proteinet gennem den sekretoriske reaktionsvej til visning på plasmamembranen. Vi normalt indsætte et stopkodon foran vektor-kodede transmembrane anchor for at tillade, at proteinet udskilles i det konditionerede medium.
Humane embryoniske nyre (HEK) 293T-celler er bredt tilgængelige og let dyrkes og transficeres. HEK-293T anvendes rutinemæssigt til ekspression af proteiner fra pattedyr, men anses for biologisk og bør håndteres ved biosikkerhedsniveau 2. Du bære korrekt personlige værnemidler, arbejdet skal udføres i et godkendt biosikkerhed skab ved hjælp af aseptisk teknik. Alt affald og overflader skal desinficeres i henhold til institutionelle og statslige retningslinjer. Det anbefales, at celler testes for mycoplasma kontaminering før anvendelse. Celler kan behandles med ciprofloxacin (10 ug / ml) i ti dage for at udrydde kilde mycoplasma spp. kontaminering. Generelle protokoller til at udbrede HEK-293T celler præsenteres særskilt (boks 1).
Yderligere overvejelser for test-og store protein-ekspression er reviewed i 11-15.
2. Små-skala test Expression
Når konstruktionerne er blevet designet og frembringes, små test transfektioner kan udføres under anvendelse HEK 293T-celler; en skematisk oversigt fremgangsmåden vist nedenfor (fig. 1).
- Brug T75 cm 2 eller T225 cm 2 celledyrkningskolber (afhængigt af antallet af test-udtryk, der skal udføres) til at vokse HEK 293T celler og opdele celler hver 2-3 dage, hvor cellerne er 100% sammenflydende (boks 1).
- Frø 2,5 x 10 5 HEK 293T celler per brønd i en 6-brønds plade og der tilsættes 2 ml DMEM med 1X pen / strep og 10% (v / v) FBS, hvirvelkaviteten pladen forsigtigt for at sikre en endnu celle spredning i hver brønd, og inkuberes natten over ved 37 ° C i en 5% CO 2 befugtet kammer.
- Når HEK 293T-celler på 40% konfluens, kasseres medier og tilsættes frisk 2 ml DMEM med 1X pen / strep og 10% (v / v) FBS til brøndene. Udførtransfektionsassays.
- Portion 90 pi serumfrit DMEM i en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pipetten 3 pi GeneJuice i serumfrit DMEM og forsigtigt blandes røret (finger vortex). Inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 1 ug miniprep oprenset plasmid-DNA (DNA lager = 100 ng / ul) i DMEM-GeneJuice blanding finger vortex, og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Pipettere transfektionsblandingen blandingen dråbevis på HEK 293T-celler, og bland i 6-brønds plade forsigtigt for at tillade en jævn fordeling af transfektionsblandingen. Inkuber i 6-brønds plade ved 37 ° C i en 5% CO 2 befugtet kammer.
- Tilsæt 1 ml frisk DMEM med 1X pen / strep og 10% (v / v) FBS til hver brønd 24 timer efter transfektion og inkuberes i yderligere 48 timer (i alt 72 timer).
- Høst 1 ml supernatant fra hver brønd til tre dage efter transfektion og mikrocentrifuge prøverne ved 16.000 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Gennemfør wesmønster blot-analyse som beskrevet i boks 2. Prøver kan opbevares ved 4 ° C. Længden af opbevaring ved 4 ° C er protein-afhængig.
3. Storstilet Test Ekspression og oprensning
Når et konstrukt er blevet identificeret milligram mængde ekspression af rekombinant protein opnås ved PEI transfektion af adhærente HEK 293T-celler under anvendelse af 10-lags cellefabrikker (fig. 2; 6360 cm2 overfladeareal). Flere forundersøgelser, kan mindre cellefabrikker eller T-kolber (tabel 1) anvendes.
- Oprense 1 mg DNA til transfektion under anvendelse af en MaxiPrep plasmidoprensning kit. En 500 ml natten over kultur af XL-1 Blue-celler skulle producere mindst 1 mg rent DNA. Kontrollere renheden af DNA ved at måle A 260 / A 280-forhold bør være over 1,8.
- Opskalere HEK 293T-celler til 2,0 x 10 8 celler. Hver T225 cm2 kolbe dyrket til 100% konfluens contains og gennemsnitlige på ~ 2,25 x 10 7 celler.
- Tilsæt 1,2 L DMEM med 5% (v / v) FBS til en 10-lags cellefabrik. Tilsæt 2,0 x 10 8 HEK 293T celler til cellefabrikken og fordele celler jævnt på alle lag af fartøjet. Det er meget vanskeligt at visualisere sammenflydning af celler i cellefabrikken. Som et alternativ etablere en T75 cm2 kolbe med et passende antal celler, under anvendelse af samme celle nummer i forhold til overfladearealet, som udføres med 10 lag beholder. Overvåg denne kolbe til vækstrater. Se tilhørende video for instruktion om håndtering af cellen fabrikken. Inkuber natten over ved 37 ° C med 5% CO 2 tillade cellebinding og vækst.
- Udføre omfattende transfektion, når adhærente HEK 293T-celler 70% sammenflydende. Klargør PEI-DNA-transfektion blanding (03:01 w / w PEI til DNA-forhold) i en biosikkerhed kabinet med en steril T75 cm2 kolbe. Blandes 0,84 mg DNA med 84 ml steril 1X PBS, hvorefter der tilsættes 2,5 ml af PEI (2.5 mg total PEI). Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter. Opløsningen skal være uklar.
- Hæld PEI-DNA-transfektion blandingen langsomt i cellen fabrikken og grundigt fordele over alle lag af fartøjet. Valgfrit: for forøget ekspression udbytte, valproat (4 mM slutkoncentration) tilføje. Inkuber ved 37 ° C med 5% CO2 i fire dage.
- Høst supernatanten fire dage post-transfektion. Centrifugeres det konditionerede medium ved 6000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Yderligere filtreres supernatanten under anvendelse af en 0,22 um Stericup vakuumfilter apparat. Den 10-lag cellefabrik kan genbruges, se boks 3 for vejledning omkring rengøring. Det er afgørende, at rengøring påbegyndes umiddelbart efter supernatanten høst, lad ikke de celler tørre på skibet overfladen.
- Koncentreres supernatanten til 75 ml med Centramate tangentielstrømningsfiltrering system.
- 500 ml PBS og igen koncentreret til 75 ml. Gentag tre additional gange til fuldstændig bufferudskiftning prøven.
- Ækvilibrere en 1 ml anti-HA-affinitetssøjle med 1X PBS, og anvender koncentrerede prøve ved tyngdestrømning med en hastighed <1 ml / min.
- Vaskes søjlen med 30 ml 1X PBS-Tween20.
- Opløs HA-peptid i 1X PBS (1,0 mg / ml) og inkuber ved 37 ° C.
- Anvendes 1 ml af HA-peptid til anti-HA-søjle og tillader peptidet at strømme ind i harpiksen. Opsamle strømmen igennem. Standse strømningen, når peptidet opløsningen når lejehøjde.
- Inkuber hele anti-HA-søjle ved 37 ° C i 15 minutter.
- Gentage trin 12 to yderligere gange.
- Anvendes 1 ml 1X PBS til anti-HA-søjle og flyde ind i harpiksen, indtil den når lejehøjde. Opsamle strømmen igennem.
- Regenerere anti-HA-søjle med 10 ml 0,1 M glycin pH 2,2. Vaskes med 10 ml PBS og opbevares affinitetssøjle ved 4 ° C i PBS med 0,02% (w / v) NaN3.
- Udfør SDS-PAGE-analyse og samle de fractions i overensstemmelse hermed. Bemærk: HA-peptid vil interferere med proteinkoncentration målinger af A 280 eller Bradford. At estimere mængden af tilstedeværende protein, belastningen 5, 10, 15, 25 ug BSA på SDS-PAGE-gel som en standard og sammenligner båndintensiteter.
Trin 9-17 kan gentages til at indfange yderligere protein fra det konditionerede medium.
4. Repræsentative resultater
I denne artikel beskriver vi og demonstrere et praktisk udtryk platform for milligram-mængde produktion af humane proteiner, der efterfølgende kan anvendes til strukturelle og funktionelle studier. Screening af humane protein konstrukter under anvendelse HEK 293T-celler i 6-brønds plader er effektiv til at identificere konstruktioner kan underkastes større skala. Kommercielle ekspressionsvektorer kan transficeres effektivt i HEK 293T celler ved anvendelse af en række transfektionsreagenser, såsom GeneJuice, FuGene HD eller PE I. Vi anbefaler brugen af en kommerciel transfektion reagens, såsom GeneJuice eller FuGene HD, for test udtryk, da disse reagenser er mere effektive for de fattige, der udtrykker proteiner (Fig. 3). Konstruktioner udvalgt til større skala udtryk skal være præget af en enkelt, stærk intensitet band, svarende til den rette molekylvægt på Western blot (Fig. 3). Glycoproteiner kan migrere som en bredere band på grund af heterogenitet i glycosylering. Vi har vist, at en række makromolekyler, der spænder fra virale glycoproteiner, cytokiner, cytokin-receptorer og andre overfladeaktive proteiner, kan udtrykkes og oprenses til opnåelse millgram mængder af protein ved hjælp af denne generelle udtryk platform (fig. 4).
Figur 1. Workflow skematisk af små transfektioner.tp_upload/4041/4041fig1large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 2. Corning 10-lags CellSTACK til større skala proteinekspression. Hvert lag indeholder 636 cm2 overfladeareal til cellevedhæftning. En standard laboratorium CO 2 inkubator (6,0 cu. Ft) vil mageligt holde fire 10-lag cellefabrikker.
.. Figur 3 Små-skala ekspression af forskellige udskilte proteiner Vi udførte en serie af små-skala test udtryk ved hjælp af fælles transfektionsreagenser:. GeneJuice, FuGene HD og PEI (a) Western blot screening af udvalgte humane cellulære proteiner (tetherin), receptorer (IL-2R β-underenhed) og cytokiner (IL-2). Tetherin er et humant membranglycoprotein, der begrænser frigivelsen afspirende HIV-1-virioner 16. Det ekstracellulære domæne af tetherin eksisterer som et glycosyleret, disulfidbundet dimer på ~ 36 kDa. Under reducerende betingelser, som vist her, migrerer tetherin som en monomer med en tilsyneladende molekylvægt på ~ 22 kDa. Interleukin-2 (IL-2) er et cytokin (ca. 17 kDa) er involveret i lymfocyt-proliferation 17. Det interagerer med IL-2 receptor-komplekset, som IL-2R βsubunit (ca. 26 kDa) er en komponent 18. CD21 er et membranprotein involveret i aktiveringen og modning af B-celler af komplement-systemet, og er også en receptor for Epstein-Barr-virus. Den glycosylerede ekstracellulære domæne af CD21 migrerer som en monomer med en tilsyneladende molekylvægt på ~ 20 kDa. (B) Western blot screening af valgte overflade virale glycoproteiner (XMRV env og ebolavirus GP). XMRV og ebolavirus glycoproteiner (transmembrane anker udgår) findes ved den virale membran trimere pigge og er involveret i værtscellen fastgørelseog fusion. Ectodomænet for XMRV Env og EBOV GP er stærkt indrettet med N-bundne glykaner og migrere til tilsyneladende molekylvægte på 70 kDa og 75 kDa.
Figur 4. Renset humane cellulære proteiner fra store HEK-293T kulturer. Alle proteiner blev udtrykt under anvendelse af en 10-lags cellefabrikken og koncentreret og oprenset ved hjælp af anti-HA-kromatografi. Som vist ved Coomassie-farvet SDS-PAGE-analyse, de ekstracellulære domæner af interleukin-2 receptor (IL-2R) α-og γ-underenheder migrere ved molekylvægte på 40 kDa og 46 kDa. Det ekstracellulære domæne af tetherin migrerer som en dimer, under ikke-reducerende betingelser med en tilsyneladende molekylvægt på 36 kDa. Bemærk, at der er en vis BSA forurening, der vises ved en tilsyneladende molekylvægt på 60 kDa. Derudover præsenterer heterogeniteten af de N-koblede glycans på tetherin,IL-2R α-og IL-2R γ årsager bånd udvidelse på SDS-PAGE-gel. Disse kompleks-type N-bundne glykaner kan fjernes ved hjælp af peptid: N-glycosidase F.
| Vessel | Overfladeareal |
| 6-brønds plade | 9,5 cm 2 (hver brønd) |
| 100 mm skåle | 55 cm 2 |
| 245 mm skåle | 500 cm2 |
| T75 cm2 kolbe | 75 cm 2 |
| T175 cm2 kolbe | 175 cm2 |
| T225 cm2 kolbe | 225 cm2 |
| Roller flaske-regelmæssig | 850 cm2 |
| Rulleflaske-ekspanderet overflade | 1700 cm 2 |
| 1-lags CellSTACK | 636 cm2 |
| 2-lags CellSTACK | 1272 cm 2 |
| 5-lags CellSTACK | 3180 cm 2 |
| 10 lag CellSTACK | 6360 cm 2 |
| 40 lag CellSTACK | 25.440 cm2 |
Tabel 1. Sammenligning af cellekultur fartøjer, der anvendes til proteinekspression.
Liste over Reagens Opskrifter
100X ciprofloxacin For 10 ml opløsning, der tilsættes 10 ml deioniseret vand til 10 mg ciprofloxacin. Tilsæt 10 gl 6N HCI til fuldstændig opløsning af ciprofloxacin.
PEI (1 mg / ml) i en 100 ml opløsning, opløses 100 mg af 25 kDa lineær PEI i deioniseret vand og opvarmes til 80 ° C. Afkøles opløsningen til stuetemperatur, pH indstilles til 7,2, 0,22 um filter sterilisere alikvot og fryse ved -20 ° C i long tids opbevaring.
1X PBS i 1 L vandig opløsning: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCI, 1,4 g Na2HPO 4 (vandfrit), 0,24 g KH 2PO 4. Justér pH af opløsningen til 7,4 og fyld til 1,0 L.
1X PBS-Tween-20 til en L vandig opløsning: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCI, 1,4 g Na2HPO 4 (vandfrit), 0,24 g KH 2PO 4, 1 ml Tween-20. Justér pH af opløsningen til 7,4 og fyld til 1,0 L.
1X overførselsbuffer For en L vandig opløsning: 3,0 g Tris-base, 14,4 g glycin, 150 ml methanol.
1X SDS-PAGE kørselsbuffer For en L vandig opløsning: 3,0 g Tris-base, 14,4 g glycin, 1,0 g SDS.
SDS-PAGE reducere prøvepuffer til 10 ml opløsning: 0,6 g SDS, 3 ml glycerol, 1,8 ml 1,0 Tris-HCI, pH 6,8, 1 mg bromphenol blå, 5% (v / v) 2-mercaptoethanol.
- Vokser HEK 293T-celler i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) suppleret med 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), 1X pen / strep ved 37 ° C i en 5% CO 2-befugtet atmosfære.
- Observere celler under et inverteret mikroskop. Når celler er til 100% konfluens, fjernes og kasseres dyrkningsmedium.
- Skylles celler med 5 ml steril 1X PBS for at fjerne spor af serum. Kassér PBS vask.
- Tilsættes 2 ml 0,05% (vægt / volumen) trypsin-EDTA-opløsning til en T225 cm2 kolbe (eller 1 ml 0,05% (vægt / volumen) trypsin-EDTA i T75 cm2 kolbe) og inkuber ved stuetemperatur, indtil cellerne løsnes fra overfladen. Det er også muligt at anvende steril 1X PBS-EDTA for at frigøre HEK 293T-celler.
- Tilsættes 13 ml DMEM med 10% (v / v) FBS til en T225 cm2 kolbe (eller 9 ml DMEM med 10% (v / v) FBS for T75 cm2 kolbe) til at inhibere trypsin reaktionen.
- Split calen 1:5. En T225 cm2 kolbe, tilsættes 3 ml cellesuspension til 27 ml frisk DMEM med 1X pen / strep og 10% (v / v) FBS i en ny kultur fartøj. En T75 cm2 kolbe, der tilsættes 2 ml cellesuspension til 8 ml frisk vækstmedium. Inkuber kulturer ved 37 ° C i en 5% CO 2-befugtet atmosfære. Cellerne skal vokse til 100% sammenflydning inden for to dage.
Boks 2. Western blot analyse
- Tilsæt 10 gl SDS-PAGE reducere prøvebuffer til 30 ul cellekultursupernatant. Belastning prøver og forud farvede molekylvægtsmarkører ned på polyacrylamidgeler og elektroforese under anvendelse 1X SDS-PAGE kører buffer ved 175 V i 1 time eller indtil molekylvægtsmarkører er godt opløst.
- Gennemvæde PVDF Immobilon-P membran i 100% methanol i 1 minut for at aktivere.
- Saml western blot-apparat. Sikre PVDF membranen vender den positive elektrode og holde alle komponenter våde med 1X transfer-buffer. Avoid bobler mellem polyacrylamidgel og membranen.
- Fuldstændigt at fylde elektroforese-kammer med 1X transfer-buffer og overførsel i 1 time ved 100 V.
- Blokere membranen med 5% (w / v) skummetmælk i 1X PBS-Tween20 i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Inkuberes med monoklonalt primært antistof (dvs. 1:1000 fortynding anti-HA-mAb eller en anden passende antistof) opløst i 5% (w / v) skummetmælk i 1X PBS-Tween20 i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Vaske membranerne i 1X PBS-Tween20 i 10 minutter. Gentag to ekstra gange.
- Inkuberes med et monoklonalt sekundært antistof konjugeret med alkalisk phosphatase (1:1000 fortynding i 5% (w / v) skummetmælk i 1X PBS-Tween20) i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Vaske membranerne i 1X PBS-Tween20 i 10 minutter. Gentag to ekstra gange.
- Placer membran i en lille beholder, tilsættes 5 ml alkalisk fosfatase substraTE (BCIP / NBT)-opløsning. Farve udvikling bør ske inden for 1-5 minutter. Når ønskede bånd intensitet er nået, vaskes med deioniseret vand og lufttørre. Farven kan falme over tid, elektronisk scanne membranerne gang tørre.
Boks 3. Rengøring og genanvendelse af cellekultur fartøjer
Mens cellefabrikker er designet til at være engangsbrug, kan disse fartøjer kan genanvendes til ekstra store transfektioner ved anvendelse af følgende rengøring protokol:
- Umiddelbart efter dekantering af supernatanten fra 10-laget cellefabrik, tilsættes 20% (v / v) blegemiddel og omrystes kraftigt for at frigøre cellerne. Inkuber ved stuetemperatur i tre timer.
- Tømme beholderen og der tilsættes frisk 20% (v / v) blegemiddel og der inkuberes ved stuetemperatur natten over.
- Tømme beholderen og vaskes med 1,5 l deioniseret vand. Gentages tre gange.
- Tømme 10-laget cellefabrikken og der tilsættes 0,5 L af sterilt 1X PBS suppleret med 10X antibiotikum / antimycotikum opløsning. Opbevares beholder ved stuetemperatur og erstatte udluftning hætter til fyldning porte standard 33 mm Gevindhætter) før næste anvendelse. Bemærk: alle lag skal være helt klar efter rengøring, hvis ikke, må du ikke bruge og disponere cellefabrikken efter institutionelle retningslinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 10-lags cellefabrikker er en effektiv beholder til fremstilling af milligram-mængder af protein. En væsentlig fordel ved at anvende cellefabrikken i forhold til andre traditionelle beholdere, såsom rulleflasker og rystekolber eller spinnerkolber, er, at de ikke kræver køb af yderligere laboratorieudstyr. En standard CO 2 inkubator (ca. 6,0 cu. Ft) vil nemt rumme fire 10-lags cellefabrikker (fig. 2). Desuden kræver disse fartøjer mindre arbejdskrævende og plads end retter, kolber eller rullekolber at producere celler og proteiner, en 10-lags cellefabrik svarer til anvendelsen af 7,5 regelmæssige rulleflasker (tabel 1). Vigtigere, HEK 293T-celler tilpasse sig godt i karrene, og er meget egnet til kortvarig transfektion af PEI, hvorved der tilvejebringes en prisbillig og effektiv løsning til kommercielle transfektionsreagenser. Mens cellefabrikker er konstrueret til engangsbrug cellekultur plastvarer, vi har been i stand til effektivt at rense og genbruge disse fartøjer flere gange uden forurening spørgsmål, hvilket i væsentlig grad reducerer omkostningerne pr brug. Transient proteinekspression under anvendelse af en 10-lags cellefabrik er i stand til at producere ~ 1-10 mg oprenset protein (fig. 4), afhængigt af proteinet og dets modifikationer. Det er muligt at gå fra kloning og små ekspression afsluttet i stor skala ekspression og oprensning i omkring 3-4 uger. Sammenfattende er det en hurtig, generelt platform, der er yderst anvendelig til fremstilling af secernerede humane eller virale overfladeproteiner. Desuden kan denne platform også anvendes til at udtrykke antistoffer, viruslignende partikler, og adenovira og lentivira til genoverførsel.
Vi har listet nedenfor fælles problemer og mulige løsninger. For en mere detaljeret vejledning i fejlfinding, kan du se 14.
- Ingen eller meget lav protein udtryk:
- Dårlig hSUNDHED af cellerne-farvning af cellerne med trypan blåt for levedygtighed og test for mycoplasma kontaminering. Hvis celler har et højt antal passager (> 25 passager) og vokser langsomt, starte på en frisk med nye HEK-293T celler. Transfektionseffektivitet og protein produktion påvirkes af alder af cellerne i kultur.
- Dårlige transient transfektion-celler bør transficeres i en konfluens på 40%. Forholdet af DNA til transfektion reagens skal optimeres.
- Proteinet er ustabilt eller ikke foldet Kontroller cellepelleten for uopløseligt protein. Teste ekspressionen af andre konstruktioner eller homologt protein.
- Intet protein elueres fra søjlen:
- Protein tilbageholdt på søjlen, elueres proteinet af interesse med 0,1 M glycin pH 2,2 og analyseres ved western blot. Hvis proteinet bevares, anvende en højere koncentration af syntetisk HA-peptid til eluering eller inkubere søjlen ved 37 ° C i længere perioder.
- anti-HA column beskadiget-Mens søjlen, hvis renses og opbevares hensigtsmæssigt, kan genbruges flere gange, vil effektiviteten af kolonnen formindskes med tiden. Brug en ny anti-HA-søjle.
- Proteinnedbrydning-Tilsæt proteaseinhibitorer og holde protein på is under hele rensningsprocessen.
- Proteinet er præcipiteret eller aggregeret på søjle-Hvis proteinet er ustabilt, prøve forskellige konstruktioner eller bufferbetingelser (dvs. pH, salte, additiver, etc.) til forbedring af proteinstabilitet.
- Protein undladt at binde til kolonne-HA-tag kan blive begravet eller utilgængelige. Kontrollere, at proteinet ikke er i strømmen gennem eller vask.
- Serum albumin forurening:
Bovint serumalbumin (BSA) har tendens til at binde ikke-specifikt til anti-HA-harpiks og kan kontaminere HA peptid elueringer. I fig. 4, BSA migrerer som en kompakt bånd ved en tilsyneladende molekylvægt på ~ 60-65 kDa. I dette tilfælde forøge Tween-20 koncentration i 1X PBS-Tween20 vask med 0,2% (v / v) og øge mængden af vasken. Alternativt kan BSA kontaminering fjernes med størrelsesudelukkelse eller ionbytningskromatografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Ontario hiv-behandling Network Research driftstilskud (ROG-G645) og canadiske Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113.554) til JEL, og University of Toronto stipendier til HA, FCA, og JDC. Forfatterne vil gerne takke Marnie Fusco, Dafna Abelson og Dr. Erica Ollmann Saphire på The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) for at give celler, ebolavirus GP ekspressionsvektoren og generel rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0x10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab')2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
