Summary

Immunoistochimica Wholemount per rivelare Topografia Cervello Complex

Published: April 05, 2012
doi:

Summary

Circuiti neurali sono topograficamente organizzate in compartimenti funzionali con specifici profili molecolari. Qui, forniamo i passi pratici e tecnici per rivelare la topografia globale del cervello utilizzando un approccio versatile wholemount colorazione immunoistochimica. Abbiamo dimostrato l'utilità del metodo che utilizza il ben capito citoarchitettura e circuiti del cervelletto.

Abstract

L'architettura ripetuto e ben compreso cellulare del cervelletto ne fanno un sistema modello ideale per esplorare la topografia del cervello. Alla base della sua citoarchitettura relativamente uniforme è una complessa serie di domini parasagittali del gene e l'espressione delle proteine. La compartimentazione molecolare del cervelletto si riflette l'organizzazione anatomica e funzionale delle fibre afferenti. Per apprezzare pienamente la complessità di organizzazione cerebellare in precedenza abbiamo affinato un approccio wholemount colorazione ad alto rendimento per l'analisi dei difetti di patterning nel cervelletto mouse. Questo protocollo descrive in dettaglio i reagenti, strumenti e misure pratiche che sono utili per rivelare con successo pattern di espressione delle proteine ​​nel cervelletto topo adulto utilizzando immunostaining wholemount. I passaggi qui evidenziati dimostrare l'utilità di questo metodo utilizza l'espressione di zebrinII / aldolaseC come esempio di come la topografia sottile del cervello può essere rivelato nel suonativo conformazione tridimensionale. Anche descritto sono adattamenti al protocollo che permettono la visualizzazione di espressione della proteina in proiezioni afferenti e cervelletti grande per gli studi comparativi di topografia molecolare. Per illustrare queste applicazioni, i dati di colorazione afferente del cervelletto di ratto sono inclusi.

Protocol

1. Animal perfusione e dissezione Cervelletto A seconda della proteina, perfusione può essere essenziale per 1,2 colorazione successo. Perfusione transcardiaca è invasivo, non la sopravvivenza procedura che richiede il corretto uso di anestetici. Corretta formazione, approvazione istituzionale, e l'approvazione IACUC sono tutte necessarie prima di tentare la procedura. E 'sempre una buona idea di consultare i veterinari dell'ente per ottenere aiuto per identificare i requisiti sperime…

Discussion

Abbiamo descritto i dettagli tecnici necessari per la colorazione wholemount successo con un approccio versatile immunoistochimica per l'espressione delle proteine ​​rivelatrici nel cervello in via di sviluppo e adulti. Usando questo approccio, complessi schemi di espressione molecolari possono essere analizzati e topografia cervello apprezzato senza la necessità di procedure tessuti laboriose e richiedono tempo sezionamento.

Questo protocollo è stato usato per rivelare l'espre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

RVS è sostenuta da investigatore nuova start-up fondi da Albert Einstein College of Medicine della Yeshiva University.

Materials

Materials Function in protocol
Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2) Allows for consistent and slow perfusion.
Sharp-tip Scissors (FST/14081-08) General use in perfusion and dissection.
Blunt-tip Forceps (FST/91100-12) To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle.
Forceps (FST by Dumont AA/11210-10) For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection.
Nutator (Fisher Scientific) Used to keep tissue in motion during incubation periods. 
1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube) All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion. 
Perforated spoon (FST/10370-17) Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution.
Leica MZ16 FA microscope Used to examine wholemount staining.
Leica DFC3000 FX camera Used to capture wholemount images.

Table 1.

Example calendar for a typical wholemount experiment
Day 1 Dent’s fix, room temperature, 8 hrs Dent’s bleach, 4°C, overnight
Day 2 100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each 100% MeOH, Freeze/thaw,
4x, 30 min/15 min
100% MeOH, -80°C, overnight
Day 3 50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min 15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min 100% PBS, room temperature, 60-90 min 10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min 100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each PMT, 4°C, overnight
Day 4-5 PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs
Day 6 PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex)
Day 7 PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each PBT, room temperature, 2 hrs Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized

Table 2.

Recipes (*=prepare fresh every time)
PBS (phosphate buffered saline) 0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417)
PFA (Paraformaldehyde) Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353)
Dent’s Fixative3* 4 parts methanol
1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4)
Dent’s Bleach3* 4 parts methanol
1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4)
1 part 30% hydrogen peroxide
Enzymatic Digestion 10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS.
PBST PBS containing:
0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.)
PMT25* PBS containing:
2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred)
0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
PBT25* PBS containing:
0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S)
0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
DAB* Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction).
ABC Complex Solution Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000)

Table 3.

References

  1. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
  2. Kim, S. -. H., Che, P., Chung, S. -. H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R. Whole-Mount Immunohistochemistry of the Brain. Current Protocols in Neuroscience. , (2006).
  3. Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus. Development. 105, 61-74 (1989).
  4. Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri. J. Anat. 204, 257-269 (2004).
  5. Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).
  6. Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
  7. Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).
  8. Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum. J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).
  9. Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum. Cerebellum. 10, 409-421 (2011).
  10. Larouche, M., Hawkes, R. From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation. Cerebellum. 5, 77-88 (2006).
  11. Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development. J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).
  12. Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis. Development. 138, 1207-1216 (2011).
  13. Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse. Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).
  14. Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry. Brain Res. 1222, 106-117 (2008).
  15. Marzban, H., Hawkes, R. On the architecture of the posterior zone of the cerebellum. Cerebellum. 10, 422-434 (2011).
  16. Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum. J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).
  17. Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4. J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).
  18. Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease. J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).
  19. Sarna, J. R., Hawkes, R. Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse. Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).
  20. El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis. Development. 135, 2981-2991 (2008).
  21. Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).
  22. Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest. Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).
  23. Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2. Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).
  24. Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).
  25. Davis, C. A. Whole-mount immunohistochemistry. Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).

Play Video

Cite This Article
White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography. J. Vis. Exp. (62), e4042, doi:10.3791/4042 (2012).

View Video