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Biology

のタンパク質複合体の同定 doi: 10.3791/4057 Published: November 12, 2012

Summary

マススペクトロメトリー(APMS)との組み合わせでタグ付けされたタンパク質のアフィニティー精製は、タンパク質相互作用ネットワークの体系的マッピングのため、生物学的プロセスの基本メカニズムを調査するための強力な方法です。ここでは、細菌のために開発最適化された順次ペプチドアフィニティー(SPA)をAPMSの手順を説明

Abstract

ほとんどの細胞プロセスを高分子アセンブリによって媒介されているので、タンパク質-タンパク質相互作用(PPI)および多タンパク質複合体のサブユニット組成の同定を体系的に同定は、遺伝子の機能への洞察を提供し、生物学的システム1,2の理解を高めることができます。物理的な相互作用は、質量分析法(APMS)と組み合わせて染色体タグ融合タンパク質のアフィニティー精製に基づいて近い生理的条件下で内因性のタンパク質複合体の高い信頼vialargeスケールの単離および特性をマッピングすることができます。このアプローチは正常酵母、ハエ、虫、哺乳類細胞、細菌1月6日を含め進化的に多様な生物に適用されています。特に、我々はGEを使用して、培養したグラム陰性大腸菌からアフィニティー精製、天然のタンパク質複合体のためのカルボキシ末端シーケンシャルペプチドアフィニティー(SPA)をデュアルタギングシステムを生成した基礎生物学と生物1、2、7の保存プロセスのゲノムワイドな研究に適していnetically-扱いやすいホスト実験室株。当社SPA-タグシステムは、酵母8,9のために最初に開発されたタンデムアフィニティー精製法に類似していて、非常に特異的なタバコエッチウイルス (TEV)プロテアーゼと3つのコピーの切断部位が続くカルモジュリン結合ペプチド(CBP)から構成されていFLAGエピトープ(3X FLAG)の、親和性濃縮の2連続ラウンドを可能にする。カセットの増幅後、SPA-タグおよび選択可能なマーカーをコードする配列特異線形PCR産物が統合されており、一時的に非常に効率的な異種バクテリオファージラムダ組換え系10の発現誘導さDY330背景にカルボキシ末端融合としてフレームで表現されます。カルモジュリンと抗FLAGアフィニティービーズを使用して、後続のデュアルステップ精製が高度に選択が可能大規模な文化からでも低濃度のタンパク質複合体と効率的な回収。タンデム質量分析を高感度(低ナノグラム検出限界)で安定して共同精製タンパク質を同定するために使用されます。

ここでは、 大腸菌由来の可溶性タンパク質複合体の精製と質量分析ベースの分析、我々は一般的に体系的タンパク質のタグ付けに使用する詳細なステップバイステップの手順を説明します大腸菌 、スケールアップと潜在的にコンビに従順である特定の日和見病原体を含む他の細菌種に合わせて調整することができます。結果の物理的相互作用は、しばしば小説序のリンクを示唆して興味深い予想外のコンポーネントと接続を明らかにすることができます。予測はBI内多タンパク質複合体のグローバルな分子組織の解明を容易にすることができますこのような遺伝的(遺伝子遺伝子)の相互作用とゲノム·コンテキスト(GC)などの代替分子会合データとPPIデータの統合ological経路。 大腸菌に対して生成されたネットワーク大腸菌は、機能アノテーションは現在欠けているために他の微生物のオーソログ遺伝子産物の機能アーキテクチャへの洞察を得るために使用することができます。

Protocol

1。 大腸菌における遺伝子固有のSPA-タギングの構築大腸菌 DY330ひずみ

  1. SPA-タグのDNA配列及びカナマイシン抗生物質耐性マーカーカセット(菅R)が包含プラスミドpJL148は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅7のテンプレートとして使用されています。 27 BP(5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ')タグ特異的なフォワードプライマーとフレーム内の標的遺伝子の終止コドンのすぐ上流に位置する45 ntの遺伝子特異的なフォワードプライマー、および45 ntの遺伝子特異的リバースプライマーは、すぐに位置して94:27 BP(5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ')タグ特異的リバースプライマーを用いたフレーム内の標的遺伝子の終止コドンの下流には、以下のPCRサイクリング条件を用いpJL148からSPAタグと菅Rのカセットを増幅するために使用される5分間℃、1分間、68で1分間、55°C、10分間68℃に続いて2分10秒の場合はC、94°Cの30サイクル。これらの増幅された配列は、サーブ異所的に導入されたλ-赤相同組換え用機械の基板(下記参照)。
  2. PCR産物は、エレクトロポレーションを妨げる可能性が塩を除去するためにQIAQUICK PCR精製キットを用いて精製する。精製したPCR産物は、その後、λ-赤組換え機構が10を発現しているDY330株における特定の遺伝子の3 '末端(ネイティブ終止コドンのすぐ上流側)に統合することをターゲットにしています。
  3. DY330λ - レッド発現株を180 rpmで振とうすることにより、32℃で2ミリリットルルリア - ベルターニ(LB)培地中で一晩増殖されています。一晩培養した培養液の1ミリリットルは続いて500ミリリットルの三角フラスコに70 mlの新鮮なLB培地に接種する。接種は、OD 600が約0.8に達するまで、180 rpmで振とうすることにより、32℃で栽培されています。
  4. 文化は、穏やかに振とうすることにより細胞を42℃の水浴中でフラスコをインキュベートすることによって誘導される新鮮な250ミリリットルの三角フラスコ、°Cに転送されます15分間180回転。すぐに誘導した後、フラスコを振とうしながら、少なくとも30分間氷水スラリー浴でインキュベートする。
  5. 氷のように冷たい文化は直ちに予冷50mlポリプロピレンチューブに移し、4℃で6分間3993 xgで遠心分離にかけ℃です。細胞ペレットを50mlの氷冷滅菌水に再懸濁し、4℃で6分間3993 xgで再び遠心分離する細胞ペレットを冷水1mlに再懸濁し、1.5ミリリットルEffendorfチューブに移し、4℃で20秒間、最大速度で遠心分離する氷冷水で2または3回の洗浄工程後、細胞ペレットを電気コンピテントセルで、その結果、氷冷滅菌水700μlにようやく再懸濁する。
  6. エレクトロポレーションにより、精製されたアンプリコンの1μlをエレクトロコンピテントセル40μlの中に導入される。 2.5kVで、パルスで25μF:細胞は、次の設定を使用してバイオ·ラッドGenePulser IIに​​エレクトロポアール200Ωのコントローラ。相同組換えと統合した後、正常染色体へのタグ/カセットを換え形質転換体は、菅( 図1A)に対する耐性に基づいて選択されます。複数の形質転換体はウェスタンSPA-タグのFLAGエピトープに対する選択的な抗FLAG M2抗体によるSPA-タグ融合タンパク質の正しい世代( すなわち、正信号)を確認するためにブロッティング用に選択されます。
  7. 確認されたカルボキシ末端のSPA-タグ融合株は、SPA精製プロトコルを使用して採取された細胞から可溶性タンパク質複合体を単離するために、大規模で培養する。アフィニティータグ精製操作に必要な手順の概要を図1Bに示されている。

2。培養すると超音波処理

  1. SPA-タグE.100μlを接種する50ミリリットルTerrificブロス(TB)に大腸菌グリセロールストックは、液体培地は、25μg/ mlのOの50μlを補充250ミリリットルの三角フラスコ中のf菅ソリューションを提供します。 32℃で一晩培養する
    注:ひずみDY330の温度誘導性λ赤カセットは温度感受性リプレッサー10の制御下にあるので、SPA-タグ大腸菌株は、32℃で栽培されている
  2. 4リットルのフラスコに菅の25μg/ mlのを補足した990ミリリットル新鮮結核に一晩培養液10ミリリットルを転送します。 OD 600が約2〜3に達するまで培養は、32℃で一定には5〜6時間、250rpmで振盪しながら成長させる。
  3. 1リットルEを転送大腸菌は、SPA-タグ·文化遠心ボトルをきれいにし、15分間ベックマン℃·J6-HCの遠心分離機@ 3993×gで4℃で細胞を回転させる。
  4. 上清を遠心分離ボトルから削除されます。 大腸菌を懸濁する超音波処理緩衝液25mlを大腸菌細胞ペレット。すべての回で、氷上で遠心ボトルを維持することを確認します。
  5. 再懸濁ペレットです50ミリリットルポリプロピレンファルコンチューブに移し、液体窒素を用いて凍結した。凍結細胞は-80℃で長期使用するために保存されます。
  6. 超音波処理に先立って、氷の上にペレットを保つことによって完全に凍結細胞を解凍します。解凍されたサンプルは、超音波処理のために氷上に置い滅菌ステンレス製のカップに移しています。プローブを試料に浸漬し、3分間超音波処理する。追加の2分間は過熱から試料を冷却する。
  7. 超音波処理した細胞溶解液をあらかじめ冷却滅菌遠心管に移し、そして二回15分間、JA-17ローター@ 35267×gで(16,000 rpm)を用いてベックマン遠心機で、4℃で遠心分離にかけられる。
    注:私達は膜タンパク質である画分にわからないので、膜タンパク質の精製の ​​場合には、超音波処理した細胞溶解液を15分間遠心分離し、一度だけ、それはペレット中または上清画分のいずれかです。だからmemの過剰損失を避けるためにブレーンタンパク質は、我々は、高速遠心分離で15分間細胞をスピンさせ、上清を、その後1%の洗剤が膜タンパク質を可溶化するために使用されている場所(以下の手順を参照)精製のために処理されます。
  8. 遠心チューブから上清を慎重に50ミリリットルポリプロピレンファルコンチューブに移し、液体窒素を用いて凍結されています。超音波処理した凍結細胞抽出物は、将来の使用のために-80℃で6ヶ月の最大期間保存されています。

3。親和性精製

  1. 使用前に、抗FLAG M2ビーズ100μlのAFCバッファー(30mMのトリス-HCl、150mMのNaCl、0.1%の洗剤、および0.1から0.5 mMのTCEP [トリス(2 -カルボキシエチル)ホスフィンの10倍量で洗浄する-洗剤なし塩酸])と還元剤TCEP(トリス(2 - カルボキシエチル)ホスフィン)。
  2. 凍結、超音波処理した細胞抽出物を冷たい水にチューブを配置することにより、解凍する。解凍した細胞抽出物をベンゾを3μlとインキュベートされる4℃で30分間naseヌクレアーゼこの混合物に、非イオン性界面活性剤トリトンX-100(界面活性剤の最終濃度が0.1%であるべきである)と抗FLAG M2アガロースビーズを200μlの懸濁液を追加します。
    注:すべての可溶性タンパク質の精製の ​​ために、0.1%トリトンX-100などのC12E8(オクタエチレングリコールドデシルエーテル)などの膜タンパク質は、別の軽度の非イオン性界面活性剤を精製するために、DDM(非特異的吸着を最小限に抑えるために使用されn-ドデシル-β-D-マルトシド)とマルトースネオペンチルグリコール(MNG)の可溶化を高めるために、1%の界面活性剤の濃度で使用することができます。別の洗剤は、膜タンパク質の可溶化効率を変化しているので、複数の洗剤を使用して独立したタンパク質の精製を行うことを推奨します。
  3. コンテンツは℃LabQuake振とう機を用いて4℃で3時間真空管を回転させることにより穏やかに混合しています。回転の3時間後、チューブを6分間1700 xgで遠心分離する。上清はその後rです緩いビーズペレットを乱さずに、できるだけ、慎重にemoved。
  4. ペレットは、残りの上清中に再懸濁させ、その後0.8×4センチメートルBio-Rad社製ポリプロピレンプレップカラムに転送されます。溶出液は、重力流によって排水できるようにするために、カラムの底コンセントプラグを削除することを確認します。 TEV切断工程でカラムを5回洗浄します。
  5. 洗浄された溶出液を排出した後、カラムの底部出口が閉鎖されている。同じ列に、切断は、カラムにTEVプロテアーゼおよび1X AFCのバッファーを400μlの約5から10μL(50単位)を追加することによって行われます。キャップ付きの列の上部を閉じることを確認します。ビーズを含む列がLabQuake振とう機を用いて4℃で一晩一晩静かに回転される。
  6. 列の下部に上部とコンセントプラグのキャップを外し、10により洗浄されるカルモジュリンセファロースビーズを200μlの懸濁液を含有する新鮮な列にTEV切断後に回収した溶出液を排出カルモジュリン結合バッファーのボリューム。
  7. と塔の上下両方がしっかりと固定され、列の内容は℃のLabQuake振とう機を用いて4℃で3時間回転させることにより穏やかに混合する。
  8. 回転の3時間後、溶出液をカラムの上部のキャップと底栓を除去することによって排出される。列は、カルモジュリンの洗浄バッファー400μLで1ジェントな洗浄が続く1Xカルモジュリン結合バッファー200μlで4回洗浄する。
  9. 結合したタンパク質を1Xカルモジュリン溶出緩衝液を用いて新鮮なエッペンドルフチュー​​ブに50μlの4画分に溶出されます。溶出画分を等量の2つのきれいなエッペンドルフチュー​​ブに分配されます。両方の管が続いて高速真空を使用して乾燥させる。
  10. 他の前の質量分析を使用し、-80℃に保存されているときに、もう1つの管からの溶出液を乾燥させ、銀染色ゲルを実行するために使用されます。

4。銀染色

  1. 銀staini用NG、3X SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、サンプルバッファの半分のボリュームは、乾燥した溶出液の50μlに追加されます。 5分間煮沸した後、試料をSDSポリアクリルアミドゲル上にロードされます。
  2. ゲルの実行が終了した後、それを慎重に固定液に入れられ(50%メタノールと10%酢酸)と20分間ロータリーシェーカーで穏やかに攪拌されています。その後、ゲルを10分間、20%エタノールでリンスする。
  3. 固定されたゲルは低い均一な背景を確実にするために10分間再蒸留水500mlで2回徹底的に洗浄する。
  4. その後、ゲルを20秒間、蒸留水で2回の洗浄工程に続いて1分間、500mlのチオ硫酸ナトリウムで穏やかに攪拌されています。
  5. 水を捨て、ゲルを30分間0.1%硝酸銀の200ミリリットルでインキュベートする。その時間が経過した後、硝酸銀が削除され、ゲルは、過剰の硝酸銀を削除するには、20秒間、蒸留水で洗浄する。
  6. ゲルがついに75mlに撹拌手である現像液の。所望の強度が達成されると、現像液は廃棄され、酢酸80mlを加えて反応を停止しています。ゲルのバンドの適切な可視化のための20分間の最小値に対して酢酸でゲルをインキュベートすることを確認します。

5。質量分析のためのタンパク質分解とサンプルの調製

  1. 乾燥した試料に、消化緩衝液50μlおよび100mM TCEP-塩酸(トリス(2 -カルボキシエチル)ホスフィン-塩酸)0.9μlを添加し、室温で45分間混合物をインキュベート 還元工程のために。次に、500mMのヨードアセトアミドを1μl添加し、サンプルのアルキル化を可能にするために別の40分間、暗所でインキュベートする。
  2. インキュベーションの第二ラウンド後、この混合物に固定化トリプシンの1μgを追加し、5時間または室温で一晩37℃でインキュベートどちらか。酢酸1μlを加えて反応を停止することを確認します。
  3. プリウェットMillipo湿潤および平衡溶液10μlを吸引による再ジップヒントピペットチップ。無駄にするソリューションを免ずる。その後、洗浄溶液10μLを吸引し、無駄にするソリューションを免ずる。二回、この手順を繰り返します。
  4. 先端までのペプチド混合物の効率的な結合は、ピペットは、ペプチド混合物を20回混ぜる。先端に付着したペプチド混合物を吸引し、洗浄溶液を分注することにより洗い流される。先端までのペプチド混合物の効率的な結合のために二度、この手順を繰り返します。
  5. 結合したペプチドを含む先端で、湿潤および平衡溶液10μlを吸引し、クリーンなエッペンドルフチュー​​ブに分注する。この工程を2回繰り返します。使用する°Cの前速度、真空中で溶出した試料を乾燥させた後、試料を質量分析によって直ちに解析することができ、または-80℃で保存。

6。 LTQオービトラップVelos質量分析計によるタンパク質同定

木曜日隔離された複合体の電子ポリペプチド成分はのLTQオービトラップVelosハイブリッドタンデム質量分析計を使用して識別されます。オービトラップは高速Velosイオントラップしながら、コントロール精製で検出無関係な非特異的なバックグラウンド汚染物のMS / MSサンプリングを最小限に抑えることが非常に優れた解像力(> 60,000全幅半値か、FWHM)と質量精度(<2 ppm)を持ってコンポーネントは、電子移動解離と衝突誘起解離の両方のモードを使用して、低濃度のペプチドを検出およびフラグメントすることができます。結果としてMS / MSスペクトルの間で高い信頼マッチはリファレンスEにマップされSEQUESTとSTATQUEST 11のような確率アルゴリズムの実行中は、評価した各照合シーケンスなどのデータベース検索アルゴリズムを使用して大腸菌タンパク質配列。合計スペクトル番号、陰性コントロール( すなわち 。モック)精製で検出されたペプチド配列の一意性と共通のバックグラウンド汚染物質をfalse-DISロー経験を達成するために考えられているcovery率。次の手順は、タンパク質の同定のために実行されています:

  1. マイクロカラムが3μmルナ〜C 18樹脂の約10 cmの満員とオービトラップ器に沿って配置されProxeonナノエレクトロスプレーイオン源にインタフェースされています。
  2. ProxeonナノフローバイナリHPLCポンプは、ペプチド分離の間に約300 nlの分-1の安定した先端流量を提供する目的で使用されます。
  3. ペプチド溶出を達成するために、有機緩衝勾配は、サンプルの複雑さに応じて設定されています。たとえば、次のような勾配は、通常、 大腸菌用に設定されている大腸菌 SPA サンプル:溶媒Bは1分間100パーセントで開催された次の4分間、100%に、38分で24%に、1分間に2〜6%から増加しているが、その後、1分で2%に減少そして最終的には15分間2%に保持します。溶媒Bが5%、HPLCグラジエント水および0.1%ギACIと95%ACNを有しているが、0.1%のギ酸と95%HPLCの勾配の水と5%ACNを持って移動相溶媒D。針の先端で流量を60分間300 nlの分-1に設定されます。
  4. 質量分析計サイクルが60,000の解像度でフル1質量走査を介して実行すると、10併用タンデムフラグメント化質量スキャンが最も強烈な前駆体イオンのために収集されています。動的除外、モノアイソトピック質量の選択、およびリアルタイムデータ依存取得装置機能が有効になっています。
  5. スペクトルは、例えば大腸菌のデータベースに対するSEQUESTなどのデータベース検索アルゴリズムを用いて検索されます大腸菌のタンパク質配列し、その結果を統計的に低い偽の発見率を確保するためにそのようなSTAQUEST 11として確率アルゴリズムを使用してフィルタリングされます。マッチが理論的なペプチド質量に比べて10 ppmの質量誤差を示すさらなる検討の対象から除かれている間のみ、高い信頼性(99%確率)候補が、選択されています。

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Discussion

ここで説明するSPAベースAPMSアプローチの重要な側面は、タギングがそれによって正常な遺伝子調節を確保し、自然な染色コンテキスト内で実行される維持( すなわち 。ネイティブ餌プロモーターが保持され、それ故に発現レベルが乱されていない)と安定的に結合したネイティブであるということですタンパク質複合体は、近内在性レベルで回収される。オペロンの極性の問題は、選択マーカーで外向き志向のプロモーターを含むことによって避けられる。このSPA-タギングの手法は、サブユニットは、細菌の細胞あたりわずか数分子にまで表現されている場合であっても、膜関連アセンブリを含む、ほぼ均一に低濃度の複合体の成分を浄化するのに十分な効果があります。全体的に、このプロトコルは、 大腸菌でタグ付けされた可溶性タンパク質の大規模セットを精製するために容易にスケールアップすることができます大腸菌又は原則としてコンビ経由タギングが可能な他の細菌種、またはtransformaその保有は当然高いもの標的遺伝子ノックアウト13のひずみライブラリを構築するために、例えば、使用されているアシネトバクター、細菌の遺伝学の新興馬車馬のようる能力、。

大規模プロテオミクス的手法に内在する主要な関心事は、無差別非特異インタラクターとスプリアス微量汚染の識別である。濃縮の2つのラウンドにもかかわらず、我々のルーチンのSPA精製は、定期的に通常のクロマトグラフィー樹脂および/または餌のタンパク質に非特異的に結合し、リボソームタンパク質とシャペロンとして高い豊富ハウスキーピングタンパク質であり、頻繁な汚染物質を検出。この問題は、2つの方法で軽減することができます。まず、特定の餌で識別された各タンパク質の総スペクトル数とユニークさは複数の無関係なタンパク質の餌の精製の ​​より広範なセットに、タグなし( すなわち 、野生型)陰性コントロール株( すなわち 。モックアフィニティー精製experからの相対パスと見なされ偽陽性の関連付けを最小限に抑えるためiments)。第二に、すべての候補タンパク質相互作用は独立して、SPA-タグの存在がに天然タンパク質の取り込みをかき乱しているまれなケースを避けるために、個々のタンパク質 - タンパク質相互作用を確認することを目標に、推定上の結合パートナーの相互タギングおよび精製を使用して検証されるべきである内因性のタンパク質の集合。

APMSベースのプロテオミクス調査は、一時的または準化学量論的相互作用を同定するという点で感度の不足によって制限されています。このような場合には、シングルステップ精製手順は弱い相互作用パートナーの検出を強化するために用いることができる。 Eの当社の継続的な、十年の長い研究の過程で大腸菌インタラクトーム、我々は新世代質量分析計の検出能力は着実に向上させる見てきました。古いインストルメンテーションは、しばしばより少ないアブの検出を妨げる、非常に豊富なタンパク質の同定再発にバイアスされていますndantが、潜在的に非常に重要な相互作用するタンパク質。逆に、我々が現在使用オービトラップのVelosハイブリッド質量分析計は著しく、それによって一時的な相互作用を含む低濃度のタンパク質の方がはるかに効率的、ハイスループット検出を可能分解能、質量精度、感度が向上しています。相互作用の性質は全く不明である場合最後に、我々は、研究者が示唆している:(i)すべての推定上のデータベースの検索に一致する信頼度スコアを割り当てるために厳格な基準を適用します。 2つ以上のユニークなペプチドとタンパク質は通常、各試合は99%以上の確率の最小尤度しきい値のカットオフで通過と仮定して、正とみなされること、(ii)でタグ付けされた餌で録画候補タンパク質インタラクタの特異性を検討することを確認してくださいネガティブコントロールタグの付いていない株(模擬実験)または無関係なタンパク質の餌で得られた結果と比較し、(iii)に往復間の未知のタンパク質を含む潜在的な相互作用を確認EST大規模精製のための対応するSPAタグ餌融合を作成したり、特定のタンパク質またはタグ特異的な抗体と従来の共免疫沈降を用いたペアワイズの相互作用を検証することによって。

現在までに、この体系的なアプローチを用いて、2750〜Eの三分の二の周りにタグ付けし、浄化するために管理している検出可能なリッチな培地1、2で培養下で発現大腸菌可溶性タンパク質。また、系統的に膜関連タンパク質複合体を単離するために、これと同じ基本的な方法を適応しているし、今残っている〜1,000 Eのそれぞれを浄化しようとしている大腸菌タンパク質は、膜結合型になると予測。彼らはしばしば効率我々は通常、SPA法に使用する抽出バッファーにより可溶化されていないため、膜タンパク質の精製は、しばしばユニークな課題を提起していますが、我々のバッファに非イオン性界面活性剤の添加は、過半数の可溶化および精製が可能E.大腸菌</ em>の膜タンパク質、我々は(バブー 、未発表データ)の日付にしようとしました。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

この作品は、イノベーションのためのカナダの財団、ゲノムカナダ、オンタリオゲノム研究所、イノベーションのオンタリオ州省、JGとAE赤発現大腸菌にヘルスリサーチ助成のカナダの協会からの資金によってサポートされていました大腸菌株DY330は、ドナルド·L·コート(米国国立がん研究所、フレデリック、メリーランド州)からの親切な贈り物だった。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201
Ampicillin Bioshop #AMP201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402
Yeast extract Bioshop #YEX 555
Glycerol Bioshop #GLY 002
K2HPO4 Bioshop #PPM 302
KH2PO4 Bioshop #PPM 303
3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330 Yu et al. (2000)10
pJL148 Zeghouf et al. (2004)7
4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281
Agarose Bioshop # AGA002
Loading dye NEB #B7021S
Ethidium bromide Bioshop # ETB444
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355
Tris Base Bioshop #TRS001
Boric acid Bioshop #BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768
DNA ladder NEB #N3232L
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104
6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler
Agarose gel electrophoresis BioRad
Electroporator Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad
42 °C water bath shaker Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator Fisher Scientific
7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001
n-butanol Sigma # B7906
TEMED Bioshop #TEM001
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA
8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395
NaCl Bioshop #SOD001
Protease inhibitors Roche #800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490
9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008
Benzonase nuclease Novagen #70746
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01
TEV protease Invitrogen #12575-015
Triton X-100 Sigma #T9284
CaCl2 Sigma #C2661
EGTA Sigma #E3889
LabQuake Shaker Thermolyne #59558
10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302
Acetic acid Bioshop t#ACE222
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100
Formaldehyde Bioshop #FOR201
Sodium carbonate Bioshop #SOC512
11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302
Acetonitrile Sigma #A998-4
Formic acid Sigma #F0507
HPLC grade water Sigma #95304
Iodoacetamide Sigma #16125
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor
250 ml conical flaks VWR #29140-045
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052
Cryogenic vials VWR #479-3221
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14
Speed vacuum system Thermo Scientific

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

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References

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Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).More

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

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