細菌の凍結乾燥と細胞の生存への影響のための処方

Summary

凍結乾燥は、多くの場合、生菌細胞の乾燥製品を得るための簡単​​で便利な方法です。プロセスの問題は、細胞生存ある。ここで我々は細部、凍結乾燥時の細胞の生存が使用製剤の特性によって影響されるか調査する手順を。

Abstract

セルラ水を可逆的に保管を容易にするために、微生物を不活性化するために除去することができる。除去のそのような方法の一つは、穏やかな脱水方法考えられる凍結乾燥である。乾燥中の細胞生存を促進するために、細胞は、しばしば、予め処方される。製剤は、細胞を埋め込み、凍結乾燥中のセルに課される種々の有害なストレスからそれらを保護マトリックスを形成する。ここでは、凍結乾燥後の細胞の生存率を評価する一般的な方法を提示し、我々は、4つの異なる処方で得られた結果と比較することによってそれを示している：二糖スクロース、ポリマーフィコールPM400由来のスクロースを、各多糖類、ヒドロキシエチルセルロース（HEC細菌の2株、P.上）とヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、 プチダ KT2440とA. chlorophenolicus A6。本研究では、凍結乾燥用製剤を調製する方法と、機械式を調査する方法を示し示差走査熱量測定（DSC）、表面張力の測定は、X線分析、および電子顕微鏡を用いて、生存率にそれらのデータを関連付ける製剤を特徴付けることによって再水和後の細胞生存のイズム。ポリマーは、程度の差は、それぞれの多糖類に似た白糖の単量体構造を得るために選ばれました。この方法の設定を用いて、我々は、ポリマーは、製剤の特定の物理的特性が制御される場合、二糖類¹と効果的に細胞生存をサポートできることを示した。

Protocol

1。 P.の栽培と収穫プチダ

1. Pのコロニーをトリプシン大豆ブロス100mlの（TSB）を接種することによりシュードモナスのスターター培養を準備プチダ細胞は、トリプシン大豆ブロス（TSA）を補充した培地で培養した。 130 rpmで設定揺れボードに30℃で文化を保つ。
2. 7時間後は、新鮮なTSB-培地に本培養の最終容量のスターター培養と同等の1/10〜アリコートを転送します。 16時間130 rpmで振盪ボードに30℃で細胞を保管してください。
3. 成長の16時間後、細胞を室温で20分間、1,500 xgで細胞培養物を回転させて回収する。上清を除去し、細胞ペレットを増殖培地に等張であるのNaCl溶液中で再懸濁することによって細胞を洗浄。この場合、150mMのNaCl溶液を用いた。 、次いで、細胞を再び遠心分離し、上清を処方培地で細胞を再懸濁する前にデカントステップ3.2を参照してください。

2。他の種の栽培

1. 他の細菌種にプロトコルを適合させるために栽培や収穫手順は、その種の要件に応じて変更されるべきである。収穫及び洗浄工程（複数可）中に細胞を取り扱う際浸透圧ショックを回避するために、溶液のオスモル濃度は、収穫時の増殖培地のことを一致させる必要がある。

3。細胞の策定

1. それぞれのマトリックス成分を計量することによって定式化ソリューションを準備し、水に溶解する。等張条件を達成するために、いずれかの賦形剤の量を調整したり、所望の重量オスモル濃度に到達するためのNaClまたはいくつかの他の細胞適合溶質を加える。このような二糖類などの低分子量物質の量は、容易に等張条件に達するように調整することができる。高分子であるポリマーのような物質については、張は、セルと互換性で調整する必要がありますリュート、 例えば塩化ナトリウムまたは二糖類。物質の任意の添加が交互に凍結乾燥挙動と細胞生存に影響を及ぼし得る製剤の物理的特性に影響を与えることに留意されたい。
2. 洗浄液（この場合、NaCl）を、それぞれの製剤のメディアで再懸濁細胞をデカント。
3. 細胞が均一に分散していることを確認します。高い粘度の配合物は、例えば 。、攪拌棒を添加し、均質な混合が達成されるまで、容器を振盪することにより混合して使用するのに対し、低粘度の配合物をボルテックスしている。
4. 凍結乾燥バイアルに処方を分ける。凍結乾燥中に除去される水の量を計算するために凍結乾燥前と後のバイアルを試料と、空の計量されるべきである。
5. バイアルを凍結乾燥機内に封入される場合はバイアルにゴム栓を追加するには、ステップ4.3を参照してください。
6. 凍結乾燥前に、各製剤中の細​​胞を列挙、ステップ6を参照してください。
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4。フリーズドライ

1. 凍結乾燥条件は、配合物の物理的特性に調整されなければならない。最も重要なパラメータは、この場合、ガラス転移温度、Tgは、配合物、水が依然として存在であることを示すために、凍結濃縮試料についてのTg 'を付している。凍結濃縮製剤のTg 'を容易に示差走査熱量測定（DSC）を用いて測定され、ステップ7を参照してください。
2. 試料の温度は試料のTgを下回ると、チャンバ圧力は、すなわち、セカンダリ製剤中の氷、すなわち一次乾燥し、残留水を迅速に昇華を可能にすることを常にあるように、凍結乾燥プロセスのパラメータを調整する乾燥。試料温度は、乾燥プロセスの間に "Tgを超えている場合は有意に細胞の生存を減少させることができる試料の構造崩壊の大きな危険性がある。
3. fの後に乾燥した製品を保護するためにreeze乾燥サンプル雰囲気が制御されなければならない。可能であれば、真空凍結乾燥サイクルの終了時に解放される前に、凍結乾燥機でサンプルを密封する。あるいはバイアルは好ましい雰囲気を充填することができる。それは、ストレージ大気中の湿気や酸素の存在のような周囲条件にサンプルをさらすことを避けるために重要なのは、細胞の生存に影響を与える。
4. バイアル重量を量る。

5。水分補給

1. イオンと滅菌水でサンプルを再水和。添加する水の量は、凍結乾燥の間に除去し、空バイアル、凍結乾燥前と後の試料と同じバイアルの重量から計算される量とが同じでなければならない。サンプルは今、もう一度、次にソリューションが均質に表示されるまでボルテックス。

6。列挙

1. 各サンプルから100μlのを描画し、10倍連続希釈を行います。統合の希釈から残りの100μlをTSAプレート上にメッキされています。プレートは、必要な温度および時間でインキュベートする。

7。凍結挙動の定式化の特性

1. 少量、5取る - 10 mgの、サンプルのと蓋付きDSC-アルミパンで囲みます。リファレンスとして空の鍋を準備します。
2. DSC温度スキャンプログラムを設定します。冷却プログラムは、凍結乾燥番組で凍結工程を模倣するように設定されている。これは、冷却速度論のように行われる水和製剤のTg 'に影響を与えることができる。加熱スキャンによく、通常調査製剤の予想Tgが '、100℃以下の温度を下げる開始する前に
3. 40℃/分が使用されている - 適切な加熱速度、5の通常加熱速度を選択してください。記録された熱流量信号がワットで表され、加熱速度によって影響を受ける。高い加熱速度はTgが 'の大きな信号を与える。
4. 温度範囲を設定しているので、私tはTgが 'と製剤の融解の両方をカバーしています。

8。和製剤の表面張力測定

1. この実験で使用実験は、表面を測定するデュNoüy方法に従ってされる。
2. 慎重にプラチナリングと測定容器を清掃します。容器は、アセトンですすぎ、糸くずの出ないティッシュで拭いた後、無色の炎で内側に燃焼される。リングは無色の炎で赤点灯します。
3. 溶液を容器に記入し、表面が測定する前に解決することができます。平衡状態だけ久しぶりに達したソリューションについては、 例えばポリマーは、ここで使用される単純なセットアップでは定性的なデータを提供します。
4. 高い粘度、 例えば 2％の溶液（w / w）のHEC又はHPMCとの配合物については、表面張力が低い濃度の溶液で測定する必要があり、その後補外。これは、その事実を利用することによって行うことができる0.5％以下の濃度（w / w）の時の表面張力レベルオフの低下。

9。乾燥製剤のX線解析

1. マトリックス/細菌の少量を取り、サンプルホルダーにそれをロードします。
2. X線回折装置に試料ホルダーをマウントします。
3. サンプル内の任意の結晶相の存在を分析したBrukerからEVAプログラムパッケージを使用することができる。

10。電子顕微鏡法

1. バイアルのうちマトリックス/細菌の少量を取り、SEMスタブにそれを修正する。
2. スパッタコーター（本研究で使用するサーモVGScientificポーラロンSC7640）やコートのAu / Pd又はPtを数nmと、試料中のSEMホルダーをロードします。これらの実験ではスパッタのパラメータは次のとおりだった：1,900 V、20ミリアンペア、そして20秒〜5のために - は10nmのAu / Pdをコーティング。コー​​ティングは、画像取得時の電気の帯電を軽減します。充電が解消されないと、画像の原因となるかどうかは、薄いコーティングで開始することが推奨され、アーティファクトは、試料を再びコーティングされるべきである。
3. SEM室にSEMホルダーをロードします。適切な撮像パラメータを選択します。 図2（FEIストラータDB235）で使用される楽器のために私達は5 kVの加速電圧、スポットサイズ3、5ミリメートルと二次電子検出器の作動距離を使用していました。
4. 場合により、さらなる詳細を明らかにするためにポリマー中に埋め込まれた細菌の断面を切断するために集束イオンビームを使用することが可能である。

Representative Results

製剤組成物、凍結製剤の加熱時にDSCによって記録された熱事象、乾燥試料の構造及び製剤溶液の表面張力の表1に表示されるデータである。スクロース_の Tg 'は-40°C ^2、図3に決定された、20％w / wの下方スクロース濃度を検出するために困難であり得る。 -35の熱イベント°Cは、おそらく氷の溶解²の発症に関連しています。結晶構造HECとHPMC試料でX線によって検出され、また、（図2bおよび2cを参照） を SEMで見られるには、NaClの通常の結晶形と重なる。

図1Aは、グラム陰性P.の生存データを示すプチダおよびグラム陽性A. chlorophenolicusは異なる糖ベースの製剤中に配合。製剤は、細胞の生存を支えるどれだけの傾向ではBOのために同じであることに注意してください番目の細菌種。 図1Bに示すようにプロットは、凍結乾燥製剤の生存および表面張力との相関を示す図である。

図2は、乾燥した配合物のSEM-像を示す。細菌が埋め込まれており、波形として表示されている相互接続された滑らかなシート：ここに示す4つのポリマーは、形成された行列は、 "さわやかな紙"の外観を持っています。フィコールとショ糖の場合、シートは約1μm厚さ10アール - 20μm幅、フィコールは滑らかな表面を有すると。 HPMC及びHECは、ポリマーの量は、他に比べてこれらのセルロース系製剤（ 表1）未満であるという事実のために、おそらくはるかに薄いシートを形成する。また、塩の結晶は、ポリマーシートの表面に析出物のより大きな量を示す後者は、HECとHPMCを観察した。シートは番目であるため、細菌がより容易にセルロース系製剤中に見られるインナー。スクロースおよびフィコール、これらは主に他の方法で平滑な表面の波として観察される。

配合成分	凍結製剤で検出サーマルイベント	乾燥製剤の構造	未乾燥製剤の表面張力（MNメートル-1）
10％ショ糖	氷の溶解の発症、-35°C	アモルファスショ	72±0.1
10％フィコール、150mMのNaCl	T g ' が 、-22°C	アモルファスフィコール	68±0.3
2％のHEC、150mMのNaCl	氷およびNaClの共晶融解、-28°C	アモルファスHEC、結晶のNaCl	64±0.6
2％HPMC、150mMのNaCl	氷およびNaClの共晶融解、-27°C	52±0.8

表1。水性または乾燥製剤の異なる製剤およびプロパティの組成物。HECとHPMCのポリマー濃度は、細菌の十分な厚マトリクスカバーを達成するために最大化され、それでも粘度に関してとして実行可能なソリューションを持っていた。

P.凍結乾燥の図1）の生存率プチダ （白）とA.二糖類スクロースまたはポリマー凍結乾燥後の細胞生存率と非乾燥製剤の表面張力の間にフィコール、HECとHPMC、B）の相関に基づくソリューションに策定chlorophenolicus（グレー）。

Figure 2。 PのSEM像）スクロース、b）のフィコール、c）のHEC、d）は HPMC：四つの異なる製剤中プチダ 。細菌はで見ることが困難な）及びb）ポリマーシートは非常に厚いですし、完全に細菌を包むことができるので、C言語で）及びd）細菌は、表面に、より目立つように表示されます。 ）からdにおいて、それらは楕円形、暗い微粒子として現れるようなぜなら、その形状やコントラストの析出物塩を多量に区別することができる。

Discussion

この研究のための動機は、凍結乾燥中の細胞生存に重要であり得るいくつかの製剤特性を検討した。 図1A、異なる製剤の支持細胞の生存が類似している傾向にどれだけに示すように、真性乾燥耐性は、異なる種の間で変化するものの。それはスクロースおよびフィコールの比較で開始することが有益である。これは、細胞生存を支持するための製剤の重要な要因は、このように乾燥状態でも、細胞のタンパク質および膜の構造を維持し、脱水時に水を交換するための製剤成分の能力であると考えられる。例えばスクロース糖類だけでなく、多糖類、デンプンなどのポリマーが^5,11しないのに対し、このプロパティを示すトレハロース。ポリマーは、二​​糖類と同じ方法で膜脂質と相互作用するには大きすぎると考えられている。成功した凍結乾燥のための重要な別のプロパティ微生物のINGは凍結乾燥の間（ すなわち 。なるアモルファス固体）ガラス化するためのサポートマトリックスの能力である。アモルファス構造が分離された細胞をシールドし、維持するために有益である。興味深いことに、両方の二糖類及びポリマー凍結乾燥あれば容易にガラス化が適切に実行されます。我々の結果は、スクロースおよびフィコールベース処方の両方が凍結乾燥した後、アモルファスになることを示し、同様にうまく表1、およびサポート細胞の生存を参照してください。しかし、2つの糖の間には大きな違いがあります。スクロースとは対照的に、フィコール分子は、400キロダルトンの分子量を有する^、4、5、凍結乾燥中の脂質膜との相互作用で水を交換するには大きすぎる。さらに、フィコール分子としてそのサイズ⁶に起因し、再び、グラム陰性細菌のペリプラズム空間から禁止されている、フィコールの細胞取り込みはほとんどありません。これに基づいて、我々は、その保護効果の専らを示唆ショ糖製剤によってなdedすると細胞内の構造^7,8の水交換容量のための重要な、二糖の細胞への取り込みが主な原因ではありません。むしろ、細胞の生存をサポートするフィコールの能力は、 例えば非晶質構造フィコール、ショ糖製剤の両方に共通のプロパティ、に関係しています。

ポリマーに焦点を当て、それは細胞生存を支持するポリマー配合物の能力が変化することを図1Aから明らかである。 X線分析は、塩化ナトリウムが、凍結乾燥中に結晶化し、HECとHPMC配合物の他の方法で非晶質構造と共存することを示した。結晶性材料は、フィコール系製剤は検出されなかった。塩化ナトリウム、炭水化物^9,10中のヒドロキシル部分と複合体を形成することができる。フィコールとHECベースの製剤においてヒドロキシル部分にNaClのモル比は結晶化が検出されなかった理由を説明する、それぞれ、1：11と1:1であったフィコールベースの​​製剤である。 NaClおよびセルロースポリマーの間の相分離はまた、DSC-調査で観察された。共晶溶融を相分離が凍結状態で行われることを示す冷凍HECとHPMC-配合物の加熱時に記録した。製剤の形態および微細構造をSEM像（ 図2）によって明らかにし、DSCおよびX線データを裏付けている。細菌細胞は、HEC-シートの表面にはっきりと見えるのNaCl結晶を堆積させてシートから突出して見られます。我々は結晶として分散またはポリマー中に溶解するかどうか塩の状態は、細胞生存率と相関しないと結論HPMCと比較して、HEC-溶液およびフィコール溶液中で製剤化細菌の生存率との間の類似度に基づい。代わりに細胞生存が配合物の表面張力との関係を示す図で、 図1Bを参照してください。下面緊張、L用とower生存率は、細菌のために記録されています。測定された表面張力が溶質、 すなわち、スクロースおよびポリマー、および溶媒分子との相互作用を表示することに注意してください。それでも、ポリマーの表面活性が不安定な様式で細胞表面との相互作用もする傾向に関連付けることができることを間接投機を可能にする。唯一の完全に水和製剤にバクテリアを格納する際に界面活性ポリマーの負の効果は見られなかった理由を凍結中の溶質の濃度が増加したように、負の効果が説明増強することもできる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.