ניסוחים להקפאת ייבוש של חיידקים והשפעתם על הישרדות תא

Summary

הקפאת ייבוש הוא לעתים קרובות דרך קלה ונוחה לקבלת מוצרים יבשים של תאים חיידקיים קיימא. נושא של התהליך הוא הישרדות תא. אנחנו נפרט כאן הליך לחקור כיצד הישרדות תא בתקופת הקפאת ייבוש מושפעת מהמאפיינים של הניסוח בשימוש.

Abstract

ניתן להסיר מים נייד כדי להשבית מיקרואורגניזמים הפיך כדי להקל על אחסון. שיטה אחת כזו היא של הסרת הקפאת ייבוש, הנחשב שיטת התייבשות עדינה. כדי להקל על הישרדות תא במהלך ייבוש, התאים לעתים קרובות מנוסחים מראש. הניסוח יוצר מטריצה ​​שמטביעה את התאים ומגן עליהם מפני לחצים מזיקים שונים המוטלים על התאים במהלך הקפאה וייבוש. אנו מציגים כאן שיטה כללית כדי להעריך את שיעור ההישרדות של תאים לאחר הקפאת ייבוש ולהמחיש את זה על ידי השוואת התוצאות שהושגו עם ארבעה ניסוחים שונים: סוכרוז disaccharide, סוכרוז נגזר פולימר Ficoll PM400, ואת סוכרים בהתאמה hydroxyethyl תאית (HEC ) וHydroxypropyl מתיל תאית (HPMC), בשני זנים של חיידקים, פ putida KT2440 וא ' A6 chlorophenolicus. בעבודה זו אנו מדגימים כיצד להכין ניסוחים להקפאת ייבוש וכיצד לחקור mechanהאיזמים של הישרדות תא לאחר התייבשות על ידי אפיון באמצעות הניסוח של קלורימטריה ההפרש סריקה (DSC), מדידות מתח פנים, בדיקת רנטגן, ומיקרוסקופ אלקטרונים והתייחסות לנתונים אלה שיעורי הישרדות. הפולימרים נבחרו כדי לקבל מבנה monomeric של סוכרוז הדומה פוליסכריד המתאים בדרגות שונות. שימוש בשיטת התקנה זו הראינו כי פולימרים יכולים לתמוך בהישרדות תא בצורה יעילה כמו disaccharides אם תכונות פיסיות מסוימות של הניסוח נשלטות ^1.

Protocol

1. טיפוח וקציר של פ putida

1. הכן את תרבות המתנע של Pseudomonas putida ידי inoculating 100 מ"ל של מרק סויה tryptic (TSB) עם מושבה של פ תאים בתרבית על putida אגר השלימו עם מרק סויה tryptic (TSA). שמור על התרבות על 30 מעלות צלזיוס על לוח רועד נקבע על 130 סל"ד.
2. לאחר 7 שעות להעביר aliquot ממקבילת תרבות המתנע עד 1/10 מהנפח הסופי של התרבות העיקרית לTSB-מדיום חדש. שמור את התאים ב 30 ° C על לוח רועד ב 130 סל"ד במשך 16 שעות.
3. לאחר 16 שעות של צמיחת התאים נקצרים על ידי ספינינג תרבית התאים ב 1500 XG במשך 20 דקות ב RT. למזוג supernatant לשטוף את התאים על ידי מחדש השעיית התא גלולה הוא בNaCl-פתרון הוא שוה למדיום הגידול. במקרה זה נעשה שימוש בפתרון 150 מ"מ NaCl. התאים אז centrifuged פעם נוספת והוא יצק את supernatant לפני resuspending התאים במדיום הניסוח,ראה שלב 3.2.

2. טיפוח של מינים אחרים

1. על מנת להתאים את הפרוטוקול למינים חיידקים אחרים יש לשנות את נהלי הטיפוח וקציר בהתאם לדרישות מאותו הזן. כדי להימנע מהלם האוסמוטי בעת טיפול בתאים בעת הקציר ושטיפת הצעד (ים), osmolality מפתרונות צריך להתאים את זה של מדיום הגידול בקציר.

3. ניסוח של תאים

1. הכן את פתרונות ניסוח על ידי שקילה את רכיבי המטריצה ​​המתאימים ולפזר אותם במים. כדי להשיג תנאים איזוטוניים, או להתאים את כמות החומר לא פעיל או להוסיף NaCl או מומס תואמת תא אחר כדי להגיע לosmolality הרצוי. לחומרים בעלי משקל מולקולרי נמוך כגון disaccharides יכולים בקלות להיות מותאמים הסכומים להגיע לתנאים איזוטוניים. לחומרים כמו פולימרים השל משקל מולקולרי גבוה, יש לו את tonicity להיות מותאם עם תא תואם כךמלה דומה באנגלית, למשל NaCl או disaccharides. שים לב שכל תוספת של חומר תשפיע על התכונות הפיסיקליות של הניסוח, אשר בתורו עשויים להשפיע על התנהגות הקפאת ייבוש והישרדות תא.
2. למזוג את פתרון הכביסה (במקרה זה NaCl) מחדש להשעות את התאים בתקשורת הניסוח המתאימה.
3. ודא כי התאים מפוזרים בצורה אחידה. ניסוחים של צמיגות נמוכה הם vortexed אילו ניסוחים של צמיגויות גבוהות יותר מעורבבים שימוש על ידי הוספה, למשל., בר ומערבב ומנער את המכל עד לערבוב אחיד מושגת.
4. לחלק את הניסוחים לתוך צלוחיות בהקפאת מייבש. את הבקבוקונים צריכים להישקל ריקים, עם מדגם לפני ואחרי הקפאת ייבוש כדי לחשב את כמות המים שהוסרה במהלך הקפאת ייבוש.
5. הוסף פקקי גומי לבקבוקונים אם את הבקבוקונים הם להיות אטומים בתוך הקפאת מייבש, ראה שלב 4.3.
6. למנות את התאים בכל ניסוח לפני הקפאת ייבוש, ראה שלב 6.
</ Ol>

4. הקפאת ייבוש

1. תנאי הקפאת ייבוש צריכים להיות מותאמים למאפיינים הפיסיים של הגיבוש. הפרמטר החשוב ביותר הוא במקרה זה את טמפרטורת מעבר הזכוכית, TG, של הניסוח, Tg מסומן 'למדגם הקפאה המרוכז כדי לציין מים, כי הוא עדיין קיימים. "Tg של הגיבוש בהקפאה המרוכז נמדד בקלות באמצעות סריקת קלורימטריה ההפרש (DSC), ראה שלב 7.
2. התאם את הפרמטרים של תהליך הקפאת ייבוש כל כך את לחץ התא שהטמפרטורה של המדגם היא תמיד מתחת Tg של המדגם ושמאפשר לסובלימציה מהירה של קרח, כלומר ייבוש ראשוני, ושאריות מים בגיבוש, כלומר המשני ייבוש. אם הטמפרטורה היא מעל Tg המדגם "במהלך תהליך הייבוש קיים סיכון של קריסה מבנית של המדגם אשר עשויים להפחית באופן משמעותי את ההישרדות הסלולרית גדול.
3. על מנת להגן על המוצרים היבשים לאחר Freeze ייבוש אווירת המדגם חייבת להיות מבוקרים. במידת האפשר, לאטום את הדגימות בהקפאת מייבש לפני הוואקום הוא שוחרר בסופו של מחזור הקפאת הייבוש. לחלופין ניתן למלא את צלוחיות עם אווירה מועדפת. חשוב להימנע מלחשוף את הדגימות לתנאי הסביבה כמו כל לחות או בהווה חמצן באטמוספרה האחסון ישפיע על ההישרדות של התאים.
4. לשקול את הבקבוקונים.

5. התייבשות

1. רעננותם את הדגימות עם מים deionized וסטרילי. כמות המים שיש להוסיף שצריכה להיות זהה לסכום שהוסר במהלך הקפאת ייבוש ומחושב מהמשקל של בקבוקון הריק, אותו הבקבוקון עם דגימה לפני ואחרי הייבוש בהקפאה. מערבולת הדגימות עכשיו ושוב מאז ועד את פתרונות מופיעים הומוגנית.

6. מניה

1. צייר 100 μl מכל מדגם ולעשות דילולים סדרתי של פי 10. מהדילולים של Inteשאר μl 100 הוא מצופה בTSA-צלחות. הצלחות מודגרת על הטמפרטורה והזמן הנדרש.

7. אפיון של גיבוש התנהגות הקפאה

1. קח כמות קטנה, 5 - 10 מ"ג, של המדגם והקף אותו במחבת DSC-אלומיניום עם מכסה. הכן סיר ריק כנקודת התייחסות.
2. הגדר את תכנית סריקת טמפרטורת DSC. תכנית הקירור מוגדרת לחקות צעד ההקפאה בתכנית הקפאת הייבוש. הדבר נעשה כקינטיקה הקירור יכולה להשפיע "Tg של הניסוחים ההתייבשות. לפני סריקת החימום מתחילה להפיל את הטמפרטורה היטב מתחת Tg הצפוי "של הניסוחים שנחקרו, בדרך כלל -100 ° C.
3. בחר שיעור מתאים חימום, בדרך כלל שיעור חימום של 5 - 40 ° C משמש / דקה. אות זרימת החום נרשם מתבטאת בואט, ותושפע על ידי קצב החימום. שיעור חימום גבוה יותר ייתן אות גדולה יותר של Tg '.
4. הגדר את טווח הטמפרטורה, כך שאנילא מכסה גם 'Tg והתכה של הניסוח.

8. מדידות מתח פנים של הניסוחים Hydrated

1. הגדרת הניסוי בשימוש בניסוי זה היא לפי שיטת Noüy du למדוד פני השטח.
2. נקה את טבעת הפלטינה וכלי המדידה בזהירות. הכלי הוא שטף עם אצטון, ניגב בממחטת נייר נטולת מוך, ולאחר מכן שרפה בצד הפנימי עם להבה חסרת צבע. הטבעת זוהרת באדום להבה חסרת צבע.
3. מלא את הכלי עם הפתרון ולתת את פני השטח להתיישב לפני המדידה. לפתרונות שבו הוא הגיע למצב שיווי המשקל רק לאחר זמן רב, כגון פולימרים, ההתקנה הפשוטה משמשת כאן יספק מידע איכותי.
4. לניסוחים בעלי צמיגות גבוהה, פתרונות למשל של 2% (w / w), יש HEC או HPMC מתח הפנים כדי להימדד על פתרונות של ריכוזים נמוכים ולאחר מכן להסיק. ניתן לעשות זאת על ידי ניצול של העובדה שהירידה ברמות מתח הפנים יורדים בריכוזים נמוכים מ -0.5% (w / w).

9. ניתוח צילום רנטגן של הניסוחים יבשים

1. קח כמות קטנה של מטריצה ​​/ חיידקים ולטעון אותו על בעל מדגם.
2. הר בעל המדגם לקרן ה-X-diffractometer.
3. כדי לנתח כל שלב נוכחי גבישים במדגם יכול לשמש את חבילת תכנית EVA מברוקר.

10. מיקרוסקופית אלקטרונים

1. קח כמות קטנה של חיידקי מטריקס / מתוך המבחנות ולתקן אותה על בדל SEM.
2. טען בעל SEM בגמגום-coater (Thermo Polaron VGScientific SC7640 משמש בעבודה הנוכחית) ומעיל המדגם עם כמה ננומטר של Au / PD או Pt. בניסויים אלו הפרמטרים היו המקרטעים: 1,900 וולט, 20 אמפר, ו20 שניות, ל~ 5 - ציפוי Au / PD 10 ננומטר. הציפוי מפחית טעינה חשמלית במהלך רכישת תמונה. מומלץ להתחיל עם ציפוי דק, ואם טעינה נמשכת וגורמת לתמונהממצאים, המדגם צריך להיות מצופים שוב.
3. טען בעל SEM בתא SEM. בחר פרמטרים הדמיה מתאימים. למכשיר המשמש באיור 2 (פיי שכבות DB235) היינו 5 קילו וולט מתח ההאצה, 3 spotsize, מרחק עבודה של 5 מ"מ וגלאי אלקטרונים המשני.
4. לחלופין, ניתן להשתמש באלומת היונים הממוקד לחתוך חתכים של החיידקים המשובצים בפולימר לחשוף פרטים נוספים.

Representative Results

טבלה 1 מציגה נתונים על הרכב גיבוש, אירועים נרשמו על ידי תרמיות DSC במהלך חימום של ניסוחים קפואים, המבנה של הדגימות היבשות ומתח הפנים של פתרונות הניסוח. "T _גרם של סוכרוז נקבע ל-40 ° C ^{2, 3} והוא יכול להיות קשה לזהות לריכוזי סוכרוז מתחת ל -20% w / w. אירוע התרמית ב-35 ° C קשור ככל הנראה לתחילתו של קרח פירוק ^2. המבנה הגבישי זוהה על ידי קרן ה-X בדגימות HPMC HEC וגם ראה בSEM (ראה איור 2b ו2 ג) חפיפה עם גביש צורה הנורמלית של NaCl.

איור 1 א מציג נתוני הישרדות לפ גראם השלילי putida וא גראם החיובי chlorophenolicus מנוסח בניסוחים מבוססי Saccharide השונים. שימו לב שהמגמה בכמה טוב את הניסוחים תומכים בהישרדות תא היא זהה עבור boמיני חיידקי ה. העלילה מוצגת באיור 1 מדגימה את הקשר בין הישרדות הקפאת ייבוש ועל פני שטח המתחים של הניסוחים.

איור 2 מראה SEM-תמונות של הניסוחים היבשים. לארבעה פולימרים המוצגים כאן, יש לו את המטריצה ​​יצרה את המראה של "נייר פריך": סדינים חלקים ביניהם שבו החיידקים מוטבעים ולהופיע כמו תלמים. לFicoll וסוכרוז, הסדינים הם כ 1 מיקרומטר עבים ו10 - 20 מיקרומטר רחב, עם Ficoll בעל משטח חלק יותר. HPMC וHEC ליצור גיליונות הרבה יותר רזים, ככל הנראה בשל העובדה שהסכום של פולימר הוא פחות בניסוחים מבוססי תאית אלה מאשר באחרים (טבלת 1). יתר על כן, גבישי מלח נצפו עבור HEC וHPMC, עם האחרון מראה כמות גדולה של משקעים על פני השטח של יריעות הפולימר. חיידקים נתפסים בקלות רבה יותר בניסוחים מבוססי התאית, כי הסדינים הם הפנימי. בסוכרוז וFicoll, הם ציינו בעיקר כקירגול מהמשטחים החלקים אחר.

הרכב ניסוח	אירועים תרמיים זוהו בניסוחים קפואים	מבנה של ניסוח יבש	מתח הפנים של הניסוחים undried (Mn מ -1)
10% סוכרוז	תחילתו של פירוק קרח, -35 ° C	סוכרוז אמורפי	72 ± 0.1
Ficoll 10%, 150 מ"מ NaCl	T G ', -22 מעלות צלזיוס	Ficoll אמורפי	68 ± 0.3
2% HEC, 150 מ"מ NaCl	היתוך eutectic של קרח וNaCl, -28 מעלות צלזיוס	HEC אמורפי, NaCl גבישים	64 ± 0.6
HPMC 2%, 150 מ"מ NaCl	היתוך eutectic של קרח וNaCl, -27 מעלות צלזיוס	52 ± 0.8

טבלת מס '1. ההרכב של ניסוחים ומאפיינים השונים של הניסוחים מימיים או יבשים. ריכוזי הפולימר של HEC וHPMC היה מוגדל כדי להשיג כיסוי מטריצה ​​מספיק עבה של החיידקים, אבל עדיין יש פתרון מעשי כלגבי צמיגות.

איור 1). A שיעורי הישרדות של הקפאה התייבש פ putida (לבן) וא ' chlorophenolicus (אפורה) כאשר נוסחו בפתרונות המבוססים על סוכרוז disaccharide או הפולימרים מתאם Ficoll, HEC וHPMC ', ב') בין הישרדות תא לאחר ייבוש להקפיא ומתח הפנים של הניסוחים שיובשו באו"ם.

Figure 2. תמונות SEM של פ putida בארבעה ניסוחים שונים: א) סוכרוז, ב) Ficoll, ג) HEC, ד) HPMC. החיידקים הם קשים לראות ב) ו ב) כי גיליון הפולימר הם די עבה ויכול לעטוף את החיידקים לחלוטין; בג) וד) את החיידקים להופיע בצורה בולטת יותר על פני השטח. בד), הם יכולים להבחין בין הכמות הגדולה של מלח משקעים בגלל הצורה והניגוד שלהם, כפי שהם מופיעים ככדוריות מלבניות, כהות.

Discussion

המניע למחקר הנוכחי היה לבדוק כמה מאפייני ניסוח שעשויה להיות בעל חשיבות להישרדות תא בתקופת הקפאת ייבוש. למרות סובלנות הייבוש הפנימית משתנה בין מינים שונים, כפי שמודגם באיור 1 א, המגמה על כמה טוב הישרדות תא תמיכת ניסוחים שונה היא דומה. זה אינפורמטיבי להתחיל עם השוואה של סוכרוז וFicoll. הוא האמין כי גורם מרכזי לניסוח כדי לתמוך בהישרדות תא הוא היכולת של מרכיב הניסוח (ים) להחליף מים במהלך התייבשות, ובכך שמירה על המבנה של החלבונים וממברנות של גם במצב היבש התא. Disaccharides כמו סוכרוז אבל trehalose גם להראות את הנכס הזה, ואילו פולימרים כגון עמילן פוליסכריד לא ^5,11. פולימרים נחשבים גדולות מדי לאינטראקציה עם שומני הקרום באותו אופן כמו disaccharides. מאפיין חשוב נוסף להצלחה בהקפאה יבשהing של מיקרואורגניזמים הוא היכולת של מטריקס לתמיכה להפוך לזכוכית (כלומר. מוצקים אמורפיים הופכים) במהלך הקפאת ייבוש. המבנה אמורפי מועיל למיגון ושמירה על התאים מופרדים. מעניין לציין, כי שני disaccharides ופולימרים בקלות להפוך לזכוכית אם הקפאת הייבוש מתבצע כראוי. התוצאות שלנו מראות שגם סוכרוז והניסוחים מבוססי Ficoll הפכו אמורפי לאחר הקפאת ייבוש, ראה טבלת מס '1, והישרדות תא תמיכה באותה מידה. עם זאת, ישנם הבדלים משמעותיים בין שני הסוכרים. בניגוד לסוכרוז, היא מולקולת Ficoll, עם משקל מולקולרי של 400 kDa, גדולה מדי כדי להחליף את המים באינטראקציות עם ממברנות שומנים בדם במהלך הקפאת ^{ייבוש-4, 5.} יתר על כן, כפי שמולקולות Ficoll מנועים מהחלל periplasmic של חיידקים גרם שליליים, שוב בגלל הגודל שלהם ^6, ספיגת הסלולר של Ficoll היא לא סבירה. על בסיס זה, אנו מציעים כי ההשפעה המגנה provided ידי ניסוח סוכרוז הוא לא בעיקר בשל ספיגת הסלולר של disaccharide, חשוב למים קיבולת החלפה של מבנים תאיים ^{7, 8.} במקום זאת, היכולת של Ficoll לתמוך בהישרדות תא יש לעשות עם מאפיינים משותפים לשניהם Ficoll וניסוח סוכרוז, למשל מבנה אמורפי.

ההתמקדות בפולימרים, ניכר מהאיור 1 א שהיכולת של הניסוחים הפולימר לתמוך הישרדות תא משתנה. ניתוח צילום רנטגן הראה כי NaCl התגבש במהלך הקפאת ייבוש ודר בכפיפה אחת עם המבנה אמורפי אחר של HEC וניסוחי HPMC. אין חומר גבישים התגלה בניסוח מבוסס Ficoll. NaCl יכול ליצור קומפלקסים עם moieties הידרוקסיל ב ^{9 פחמימות, 10.} בניסוחי Ficoll ומבוססים HEC NaCl ליחס טוחנת מחצית הידרוקסיל היה 01:11 ו1:1, בהתאמה, והסביר מדוע אין התגבשות זוהתהבניסוח מבוסס Ficoll. הפרדת פאזות בין NaCl ופולימרי התאית נצפתה גם בDSC-חקירות. היתוך eutectic נרשם במהלך החימום של HEC הקפוא וHPMC-הניסוחים מצביעים על כך שהפרדת פאזות מתרחשת במצב הקפוא. המורפולוגיה ומייקרו של הניסוח מתגלה על ידי ההדמיה SEM (איור 2) ומאששות את נתוני רנטגן DSC ו. תאים חיידקיים נראים בולטים מהסדינים עם הופקדו גבישי NaCl בבירור על פני השטח של HEC גיליונות. בהתבסס על הדמיון בין שיעורי ההישרדות של חיידקים שגובשו בפתרונות HEC-הפתרון וFicoll לעומת HPMC אנו מגיעים למסקנה כי מצבו של מלח, אם התפזרו כגבישים או מומסים בפולימר, לא לתאם עם הישרדות תא. במקום הישרדות תא מציגה מערכת יחסים עם מתח הפנים של הניסוחים, ראה איור 1. למתחים נמוכים משטח, Lשיעורי הישרדות ower נרשמים לחיידקים. שימו לב, עם זאת, מתח הפנים נמדד מציג את האינטראקציה בין המומסים, סוכרוז כלומר והפולימרים, ומולקולת הממס. ובכל זאת היא מאפשרת לספקולציות עקיפות שמשטח פעילות של פולימרים יכולה להיות קשורה לנטייה שלהם לאינטראקציה גם עם משטחי התאים באופן מערער. כריכוז של המומסים עולה במהלך הקפאה, את ההשפעות השליליות עלולות להיות potentiated להסביר מדוע ההשפעה השלילית של הפולימרים הפעילים השטח לא נראתה בעת האחסון רק את החיידקים בניסוחים הלחים באופן מלא.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.