Summary
동결 건조는 종종 실행 가능한 세균 세포의 건조 제품을 얻을 수있는 쉽고 편리한 방법입니다. 프로세스의 문제는 세포의 생존이다. 여기에 우리가 세부 동결 건조하는 동안 세포의 생존을 사용 제형의 특성에 의해 영향을하는 방법을 조사하는 절차입니다.
Abstract
휴대 물을 가역적으로 저장을 촉진하기 위하여 미생물을 불 활성화 제거 할 수 있습니다. 제거 하나의 방법은 부드러운 탈수 방법으로 간주됩니다 동결 건조입니다. 건조하는 동안 세포의 생존을 촉진, 세포는 종종 미리 공식화된다. 제제는 세포를 내장하고 동결 건조하는 동안 세포에 부과되는 각종 유해한 스트레스에서 그들을 보호하는 매트릭스를 형성한다. 우리는 여기에서 동결 건조 후 세포의 생존율을 평가하는 일반적인 방법을 제시하고 우리는 네 가지 공식으로 얻은 결과를 비교하여 보여줍니다 이당류 자당, 폴리머 Ficoll PM400 파생 된 자당, 그리고 각각의 다당류 히드 록시 에틸 셀룰로오스 (HEC 박테리아의 두 가지 변종, P.) 및 히드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스 (HPMC) 의 putida KT2440 및 A. chlorophenolicus A6. 이 작품에서 우리는 동결 건조 공법을 준비하는 방법과 mechan를 조사하는 방법을 보여줍니다시차 주사 열량계 (DSC), 표면 장력 측정, X-선 분석과 전자 현미경의 사용과 생존율에 해당 데이터를 관련 제제의 특성에 의해 재수 후 세포 생존의 ISMS. 고분자는 다양한 각도로 각각의 다당류 닮은 자당의 단량체 구조를 얻기 위해 선택되었다. 이 방법 설정을 사용하여 우리는 제제의 특정 물성 1 제어하는 경우 고분자 이당류로 효과적으로 세포의 생존을 지원할 수있는 것으로 나타났다.
Protocol
1. P.의 재배 및 수확 의 putida
- P.의 식민지에 트립신 간장 국물 100 ㎖ (TSB)를 접종하여 모나스의 putida의 스타터 문화를 준비 의 putida 세포는 트립신 간장 국물 (TSA)로 보충 한천에서 배양. 130 rpm으로 설정 떨고 보드에 30 ° C에서 문화를 유지합니다.
- 7 시간 신선한 TSB-매체에 스타터 문화 동등한에서 주 문화의 최종 부피의 1 / 10로 나누어지는을 전송 한 후. 16 시간 동안 130 rpm으로 흔들어 보드에 30 ° C에서 세포를 유지합니다.
- 성장의 16 시간 후 세포는 실온에서 20 분 1,500 XG에서 세포 배양을 회전시켜 수확. 뜨는을 가만히 따르다 및 펠렛 성장 매체에 등장합니다 염화나트륨 용액에 세포를 다시 일시 중단하여 세포를 씻으십시오. 이 경우 150 mM의 염화나트륨 용액을 사용 하였다. , 세포는 다음 번 원심 분리하고 상층 액을 배합 매체에 세포를 현탁 전에 상층됩니다단계 3.2를 참조하십시오.
2. 다른 종의 재배
- 다른 박테리아 종의 프로토콜을 적응 재배 및 수확 과정은 그 종의 요구 사항에 따라 변경해야합니다. 수확 세척 단계 (들) 동안 세포를 처리 할 때 삼투 충격을 방지하기 위해, 솔루션의 삼투압 수확의 성장 매체의 일치해야합니다.
3. 세포의 수립
- 각각의 매트릭스 구성 요소를 계량하여 배합 솔루션을 준비하고 물에 용해. 등장 조건을 달성하기 위해, 하나 부형제의 양을 조절하거나 원하는 삼투압에 도달하기 위해 염화나트륨 또는 다른 세포와 호환 용질을 추가합니다. 같은 이당류의 낮은 분자량 물질 양을 쉽게 등장 조건을 도달하기 위하여 조정될 수있다. 고 분자량의이다 중합체와 같은 물질, tonicity 그래서 호환 셀 조정할 수있다류트, 예를 들면 염화나트륨 또는 이당류. 물질의 첨가 차례로 동결 건조 행동과 세포의 생존에 영향을 미칠 수있는 제제의 물리적 속성을 영향을 미칠 것이라고합니다.
- 세척 용액을 (이 경우 염화나트륨)에 가만히 따르다하고 각각의 배합 미디어 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 세포가 균일하게 분산되어 있는지 확인합니다. 높은 점도의 공식을 사용하여 혼합 된 반면, 낮은 점도의 공식은, 예를 들면., 저어 줄을 추가하고 혼합 균질가 달성 될 때까지 용기를 흔들어 와류 있습니다.
- 동결 건조기 병에 공식 나눈다. 유리 병은 이전과 동결 건조 중에 제거 물의 양을 계산하기 위해 동결 건조 후 샘플, 빈 무게해야합니다.
- 병이 동결 건조기 안에 봉인 할 경우 병에 고무 마개를 추가 4.3 단계를 참조하십시오.
- 동결 건조 전에 각 제제의 세포를 열거, 6 단계를 참조하십시오. </ OL>
- 동결 건조 조건은 제제의 물리적 특성에 맞게 조정해야합니다. 가장 중요한 매개 변수는이 경우 유리 전이 온도 Tg가이 제제의, 물이 여전히 존재 나타 내기 위해 동결 농축 샘플 전이 '에 표시된다. 동결 농축 제제의 전이 '는 쉽게 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용하여 측정 단계 7을 참조하십시오.
- 동결 건조 공정의 매개 변수를 조정하여 시료의 온도는 시료의 Tg를 아래로하고 항상하는 챔버 압력 즉 보조, 배합에 얼음 빠른 승화, 즉 기본 건조하고 잔류 물을 수 있습니다 건조. 샘플 온도는 건조 과정에서 '위 전이의 경우 크게 세포의 생존을 감소시킬 시료의 구조적 붕괴의 큰 위험이 있습니다.
- F 후 건조 제품을 보호하기 위하여reeze 건조 시료의 분위기하여 제어 할 수있다. 가능하면 진공 동결 건조 사이클의 끝에서 해제되기 전에, 동결 건조기에 샘플을 밀봉하십시오. 또는 유리 병을 선호하는 분위기로 가득 할 수 있습니다. 그것은 저장 분위기에서 모든 수분이나 산소 선물로 주변 환경에 샘플을 노출되지 않도록하는 것이 중요하는 것은 세포의 생존에 영향을 미칠 것이다.
- 튜브를 무게.
- 탈 및 멸균 물 샘플을 재수. 추가 할 물의 양이 동결 건조 중에 제거하고 빈 유리 병, 동결 건조 전후 샘플 같은 유리 병의 무게로부터 계산되는 금액으로이 동일해야합니다. 소용돌이 샘플은 지금 다시 그 솔루션은 동질 나타날 때까지.
- 각 샘플에서 100 μl를 그리는 10 배 연속 희석을합니다. 적분의 희석에서나머지 100 μL는 TSA 플레이트에 도금되어 있습니다. 플레이트는 필요한 온도와 시간에서 배양된다.
- 소량 걸린다 5 - 10 ㎎, 샘플을 뚜껑 DSC-알루미늄 냄비로 묶습니다. 참고로 빈 냄비를 준비합니다.
- DSC 온도 검사 프로그램을 설정합니다. 냉각이 프로그램은 동결 건조 프로그램의 동결 단계를 모방하도록 설정되어 있습니다. 냉각 반응 속도가 수화 공식의 전이 '에 영향을 미칠 수 있으므로이 수행됩니다. 난방 검사에 잘 일반적으로 조사 제제의 예상 전이 '-100 ° C. 아래의 온도를 가지고 시작하기 전에
- 40 ° C / 분을 사용하는 - 적절한 가열 속도, 5 일반적으로 가열 속도를 선택합니다. 기록 된 열 흐름 신호는 와트로 표현하고 가열 속도에 의해 영향을받을 것입니다. 높은 가열 속도는 전이 '의 큰 신호를 제공합니다.
- 온도 범위를 설정하는 그래서t는 전이 '와 제제의 녹는 양을 다룹니다.
- 이 실험에 사용 된 실험 장치 표면을 측정하는 뒤 Noüy 방법에 따라합니다.
- 주의 백금 반지 및 측정 용기를 청소합니다. 용기는 아세톤으로 세척하고 보풀이없는 티슈로 닦아하고 무색 화염 내부에서 연소된다. 반지는 무색 불꽃에 붉은 빛납니다.
- 솔루션과 용기를 채우고 표면을 측정하기 전에 해결하자. 평형 상태 만 오랜 시간에 도달 한 후에 솔루션의 경우, 예를 들어 고분자, 여기에 사용되는 간단한 설치 질적 데이터를 제공합니다.
- 높은 점도 2 % 예를 들면 솔루션 (W / W)와 공식에 대한 HEC 또는 HPMC, 표면 장력이 낮은 농도의 용액에서 측정되어야하고 추정. 이 사실을 활용하여 수행 할 수있는0.5 % 이하의 농도 (w / w)에서의 표면 장력 수준을 꺼 놓습니다.
- 매트릭스 / 박테리아의 작은 금액을 가지고 샘플 홀더에 그것을로드합니다.
- X-레이 회절에 샘플 홀더를 장착합니다.
- 샘플의 모든 결정 단계 현재를 분석 브루 커에서 EVA 프로그램 패키지를 사용할 수 있습니다.
- 튜브의 매트릭스 / 박테리아 소량 밖으로 가지고 SEM 스텁에 고정합니다.
- 스퍼터 코터 (본 연구에 사용 된 열 VGScientific 폴라 SC7640) 및 AU / 팔라듐 또는 백금의 몇 m로 코트 샘플의 SEM 홀더를 넣습니다. 이 실험에서는 스퍼터링 매개 변수는 : ~ 5 1,900 V, 20mA, 20 초 - 10 nm의 오 / 팔라듐 코팅. 코팅은 영상 획득시 전기 충전을 줄일 수 있습니다. 충전이 지속되고 이미지가 발생하면 그것은 얇은 코팅으로 시작하는 것이 좋습니다되어유물, 샘플을 다시 코팅해야한다.
- SEM 챔버의 SEM 홀더를 넣습니다. 해당 이미지 매개 변수를 선택합니다. 그림 2 (FEI 지층 DB235)에 사용되는 악기에 우리는 5 kV의 가속 전압, spotsize 3, 5 mm와 이차 전자 검출기의 작동 거리를 사용했다.
- 선택적으로, 그 자세한 내용을 공개하는 고분자에 포함 된 박테리아의 단면을 잘라 집중 이온 빔을 사용할 수 있습니다.
4. 동결 건조
5. 재수
6. 열거
7. 냉동 행동 제형의 특성
8. 수화 공식의 표면 장력 측정
9. 건조 공법의 X-선 분석
10. 전자 현미경
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Representative Results
표 1은 배합 성분에 대한 자료, 냉동 공법, 건조 시료의 구조와 배합 솔루션의 표면 장력 가열하는 동안 DSC에 의해 기록 된 열 이벤트를 표시합니다. 자당의 T g '는 -40 ° C 2, 3으로 결정되었으며, 20 % w / w 이하 자당 농도에서 감지하기 어려울 수 있습니다. -35에서 열 이벤트는 ° C 아마도 얼음 용해 2의 발병에 관련되어 있습니다. 결정 구조는 HEC와 HPMC 샘플에서 X-레이 감지도 (그림 2B 및 2C 참조) SEM에서 본 것은 염화나트륨의 일반적인 결정 양식을 중복.
그림 1A는 그람 음성 P.에 대한 생존 데이터를 보여줍니다 의 putida와 그람 양성 A. chlorophenolicus은 다른 당류 기반의 공식 공식화. 공식은 세포의 생존을 얼마나 잘 지원하는지의 경향이 보에 대해 동일합니다일 박테리아 종. 그림 1B에 표시된 플롯은 동결 건조 생존과 제형의 표면 장력 간의 상관 관계를 보여줍니다.
그림 2는 건조 공법의 SEM-이미지를 보여줍니다. 여기에 표시된 네 가지 고분자 형성 매트릭스 "선명 용지"의 모양을 가지고 : 박테리아는 내장과 파형으로 표시되는 상호 부드러운 시트 한합니다. Ficoll과 자당를 들어, 시트는 약 1 μm의 두께와 10아르 - 20 μm의 폭 Ficoll은 매끄러운 표면을 갖는. HPMC와 HEC 폴리머의 양이 다른 (표 1)에 비해 이러한 셀룰로오스 기반 정립에 적은 사실 가능성 때문에 훨씬 얇은 시트를 형성한다. 또한, 소금 결정은 고분자 시트의 표면에 침전물의 큰 양을 보여주는 후자, HEC와 HPMC 관찰되었다. 시트 일 때문에 박테리아는 더 쉽게 셀룰로오스 기반의 공식에서 볼 수 있습니다내부. 자당과 Ficoll, 그들은 주로 달리 부드러운 표면의 주름으로 관찰된다.
| 배합 성분 | 열 이벤트는 냉동 공식에서 발견 | 건조 제제의 구조 | 수삼 공법의 표면 장력 (mN의 M -1) |
| 10 % 자당 | 얼음 용해의 발병, -35 ° C | 비정질 자당 | 72 ± 0.1 |
| 10 % Ficoll, 150 mM의 NaCl을 | T G ', -22 ° C | 비정질 Ficoll | 68 ± 0.3 |
| 2 % HEC, 150 mM의 NaCl을 | 얼음과 염화나트륨의 공융, -28 ° C | 비정질 HEC, 결정 염화나트륨 | 64 ± 0.6 |
| 2 % HPMC, 150 mM의 NaCl을 | 얼음과 염화나트륨의 공융, -27 ° C | 52 ± 0.8 |
표 1. 수성 또는 건식 공법의 다양한 공식 및 속성의 구성. HEC와 HPMC의 고분자 농도는 박테리아의 충분한 두께 매트릭스 덮개를 달성하기 위해 최대한 여전히 점도에 관해서는 같은 실행 가능한 해결책을 가지고 있었다.
그림 1. 동결) 생존 요금은 P. 건조 의 putida (흰색) A. 이당류 자당 또는 고분자 동결 건조 후 세포의 생존과 유엔 건조 공법의 표면 장력과 Ficoll, HEC 및 HPMC, B) 상관 관계를 기반으로 솔루션을 공식화 chlorophenolicus (회색).
에프igure 2. P.의 SEM 이미지 네 가지 공법에서의 putida :) 자당, B) Ficoll, C) HEC, D) HPMC. 폴리머 시트는 매우 두꺼운 완전히 박테리아를 포위 할 수 있기 때문에 박테리아)에 표시하기 어려운)와 b이다; C에서)와 D에게) 박테리아가 표면에 더 눈에 띄게 표시. ) D에, 그들은 소금의 큰 금액 구분할 수들은 같은 직사각형, 어두운 미립자를 나타나는대로, 때문에 그들의 모양과 명암의 침전.
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Discussion
본 연구의 동기는 동결 건조하는 동안 세포의 생존을 위해 중요 할 수있는 몇 가지 제형의 특성을 조사하는 것이었다. 고유의 건조 내성이 다른 종 사이에 차이가 있지만, 그림 1A, 다른 공식 지원 세포의 생존과 유사합니다 얼마나 잘 추세에 나와 있습니다. 그것은 자당과 Ficoll의 비교로 시작하는 정보입니다. 그것은 세포의 생존을 지원하는 제제의 핵심 요소 따라서는 건조 상태에있는 세포의 단백질과 세포막의 구조를 유지, 탈수시 물을 대체 할 수있는 배합 성분 (들)의 기능이라고 생각됩니다. 같은 다당류 전분 폴리머 5,11를하지 않는 반면, 같은 자당과 같은 이당류하지만 또한이 속성을 보여 트레할로스. 고분자 이당류와 같은 방식으로 막 지질과 상호 작용하기에 너무 큰 것으로 간주됩니다. 성공적으로 동결 건조에 중요한 다른 속성미생물의 ING는 동결 건조하는 동안 (예.가 비정질 고체) 유리화하는 지원 매트릭스의 기능입니다. 비정질 구조는 분리 된 세포를 보호하고 유지 도움이됩니다. 동결 건조가 제대로 수행되는 경우 흥미롭게도, 이당류 및 폴리머 모두 쉽게 유리화. 우리의 결과는 자당과 Ficoll 기반 정립이 모두 동결 건조 후 비정질 될 것으로 보여, 동일하게 표 1 및 지원 세포의 생존을 참조하십시오. 그러나 두 당류 사이에 큰 차이가 있습니다. 자당 대조적으로, Ficoll 분자는 400 kDa의의 분자량, 4, 5를 동결 건조하는 동안 지질 세포막과 상호 작용에 물을 대체 할 너무 큽니다. 또한, Ficoll 분자로 자신의 크기를 6으로 인해 다시, 그람 음성 박테리아의 periplasmic 공간이 금지되며, Ficoll의 세포 흡수는 않을 수 있습니다. 이를 바탕으로, 우리가 제안하는 보호 효과 provi자당 배합에 의해 DED는 세포 구조 7, 8의 물을 교체 용량 중요한 이당류의 세포 흡수 차적으로 때문이 아니다. 오히려 세포의 생존을 지원하는 Ficoll의 기능은 Ficoll과 자당 정립에 공통 속성과는 비정질 구조를 예를 들어합니다.
고분자에 초점을 맞추고, 그것은 세포의 생존을 지원하는 폴리머 공법의 기능이 변화한다 그림 1A에서 분명하다. X-선 분석은 염화나트륨 동결 건조 과정 결정 및 HEC와 HPMC 정립 달리 비정질 구조로 공존 것으로 나타났다. 어떤 결정 재료는 Ficoll 기반 정립에서 검출되지 않았다. 염화나트륨 탄수화물 9, 10 하이드 록시 잔기와 복합체를 형성 할 수 있습니다. 수산기 부분 몰비에 Ficoll과 HEC-기반 정립에 염화나트륨은 결정이 검출되지 않았다 이유를 설명, 각각 1:11 1:1이었다Ficoll 기반 정립한다. 염화나트륨과 셀룰로오스 고분자 사이의 상분리는 DSC-조사에서 관찰되었다. 공융은 상 분리가 냉동 상태에서 일어나는 것을 나타내는 냉동 HEC와 HPMC - 공식 가열하는 동안 기록되었다. 제제의 형태와 미세 구조는 SEM 이미지 (그림 2)에 의해 밝혀와 DSC와 X-선 데이터를 확증합니다. 박테리아 세포는 HEC-시트의 표면에 명확하게 볼 수 염화나트륨 결정을 입금하여 시트에서 튀어 나온 볼 수 있습니다. 우리는 결정으로 분산 또는 고분자에 용해 여부 소금의 상태가 세포 생존과 상관없는 결론 HPMC에 비해 HEC-솔루션 Ficoll 솔루션을 공식화 박테리아 생존율 사이의 유사성에 기초를 두는. 대신 세포의 생존이 공법의 표면 장력과의 관계를 보여, 그림 1B를 참조하십시오. 낮은 표면 장력의 경우, L타워를 생존율이 박테리아 기록됩니다. 측정 표면 장력은 용질, 즉 자당 및 고분자와 용매 분자 사이의 상호 작용을 표시하는 것에주의. 그런데도 고분자 표면의 활동이 불안정 방법으로 세포 표면과도 상호 작용하는 그들의 경향과 관련이있을 수 있음을 간접적으로 추측 할 수 있습니다. 용질의 농도가 동결 기간 동안 증가함에 따라, 부정적인 효과는 표면 활성 고분자의 부정적 효과를 볼 수없는 이유를 설명 potentiated 수 있습니다 때 충분히 보습 공식 만 저장 박테리아.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
작업은 DOM 프로그램과 유럽 연합 (EU) 커뮤니티 FP7 프레임 워크 프로그램의 보조금 211,684 (BACSIN)를 통해 전략적 환경 연구를위한 스웨덴 재단 (MISTRA)에 의해 지원되었다. 우리는 개념 이야기를 돕는에 대한 X-선 분석과 L. 당나라 촬영에 도움 J. Engstrand 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll PM 400 | GE-healthcare | 17-0300-10 | |
| HEC (Natrosol-M Pharm Grade) | Ashland | Gift from Ashland | |
| HPMC (Methocel F4M) | Dow | Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Tryptic Soy broth | Merck | 105459 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck | 105458 | |
| Lyostar II | FTS Kinetics | N.A. | |
| Pyris Diamond DSC | Perkin-Elmer | N.A. | |
| Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer | Bruker | N.A | |
| Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM | FEI | N.A | |
| Krüss Educational Tensiometer | Krüss | N.A. |
References
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