Formuleringen voor Vriesdrogen van bacteriën en hun invloed op de overleving van de cel

Summary

Vriesdrogen is vaak een eenvoudige en handige manier om droge producten van levensvatbare bacteriële cellen te verkrijgen. Een kwestie van het proces is overleving van de cel. We detail hier een procedure te onderzoeken hoe celoverleving gedurende vriesdrogen wordt beïnvloed door de eigenschappen van de formulering.

Abstract

Cellular water kan worden verwijderd om reversibel inactiveren micro makkelijker opbergen. Een dergelijke methode van verwijdering is vriesdrogen, die als zachte uitdroging methode. Om celoverleving tijdens het drogen te vergemakkelijken, worden de cellen vaak vooraf geformuleerd. De samenstelling vormt een matrix die de cellen ingesloten en beschermt ze tegen diverse schadelijke stressfactoren waarmee de cellen tijdens invriezen en drogen. We stellen hier een algemene methode voor de overleving van cellen na vriesdrogen en evalueren we illustreren door de resultaten verkregen met vier verschillende formuleringen: de disaccharide sucrose, saccharose verkregen polymeer Ficoll PM400 en de respectieve Polysacchariden hydroxyethylcellulose (HEC ) en hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), twee bacteriestammen, P. putida KT2440 en A. chlorophenolicus A6. In dit werk illustreren we hoe de formuleringen te bereiden op vriesdrogen en hoe de mechanismen te onderzoekenisms van celoverleving na rehydratatie Door die formulering gebruikt van differentiële scanning calorimetrie (DSC), oppervlaktespanning metingen röntgenanalyse en elektronenmicroscopie en betreffende de gegevens overlevingskansen. De polymeren werden gekozen om een ​​monomere structuur van elke polysaccharide lijkt sucrose naar een verschillende mate. Met deze methode opstelling we zien dat polymeren celoverleving als effectief ondersteunen disachariden of bepaalde fysische eigenschappen van de formulering worden gecontroleerd ^1.

Protocol

1. Teelt en oogst van P. putida

1. Bereid een starter cultuur van Pseudomonas putida door het enten van 100 ml tryptische soja bouillon (TSB) met een kolonie van P. putida cellen gekweekt op agar gesupplementeerd met tryptische soja bouillon (TSA). Houd de cultuur bij 30 ° C op een schudden plank ingesteld op 130 tpm.
2. Na 7 uur dragen een hoeveelheid van de startercultuur gelijk aan 1/10 van het uiteindelijke volume van de belangrijkste cultuur om verse TSB-medium. Laat de cellen bij 30 ° C op een schuddend boord 130 rpm gedurende 16 uur.
3. Na 16 uur groei worden de cellen geoogst door het draaien van de celkweek bij 1500 xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Giet het supernatant en was de cellen door resuspenderen de celpellet in een NaCl-oplossing die isotonisch aan het groeimedium. In dit geval werd een 150 mM NaCl-oplossing gebruikt. De cellen worden dan opnieuw gecentrifugeerd en de supernatant wordt gedecanteerd voor resuspenderen van de cellen in het preparaat medium,zie stap 3.2.

2. Teelt van andere soorten

1. Om het protocol aan te passen aan andere bacteriesoorten de teelt en oogst procedures moeten worden aangepast aan de eisen van die soort. Om osmotische shock te vermijden bij behandeling van de cellen tijdens de oogst en de wasstap (s), de osmolaliteit van de oplossingen moet overeenkomen met dat van het groeimedium bij de oogst.

3. Formulering van cellen

1. Bereid de formulering oplossingen door weging van de respectieve matrix componenten en los ze in water. Om isotone voorwaarden te bereiken, hetzij het bedrag aanpassen van de hulpstof of voeg NaCl of een andere cel compatibele opgeloste stof aan de gewenste osmolaliteit te bereiken. Voor stoffen met laag molecuulgewicht zoals disachariden bedragen gemakkelijk kan worden aangepast aan isotone omstandigheden te bereiken. Voor stoffen zoals polymeren die een hoog molecuulgewicht, de toniciteit ingesteld moet worden met een mobiele compatibele zoluiten, bijvoorbeeld NaCl of disacchariden. Merk op dat toevoeging van een stof de fysische eigenschappen van de formulering, waardoor het vriesdrogen gedrag en celoverleving kan beïnvloeden beïnvloeden.
2. Decanteer de wasvloeistof (in dit geval NaCl) en resuspendeer de cellen in de respectieve formulering media.
3. Zorg ervoor dat de cellen homogeen verspreid zijn. Formuleringen van lage viscositeit worden gewerveld terwijl formuleringen van hogere viscositeit worden gemengd met behulp van door het toevoegen, bijvoorbeeld., Een roerstaaf en schudden van de container tot homogene menging wordt bereikt.
4. Verdeel de formuleringen in de vriesdroger flesjes. Het vaccin dient leeg gewogen, met monster voor en na vriesdrogen de hoeveelheid verwijderd water tijdens vriesdrogen berekenen.
5. Voeg rubberen stoppen aan de flacons als de flacon worden verzegeld in de vriesdroger, zie stap 4.3.
6. Inventariseer de cellen in elke formulering voor vriesdrogen, zie stap 6.
</ Ol>

4. Vriesdrogen

1. Het vriesdrogen voorwaarden worden aangepast aan de fysische eigenschappen van de formulering. De belangrijkste parameter in dit geval de glasovergangstemperatuur, Tg, van de formulering, aangeduid Tg "voor de freeze-geconcentreerde monster aan te geven dat het water nog aanwezig. De Tg 'van de freeze-geconcentreerde formulering gemakkelijk gemeten met differentiële scanning calorimetrie (DSC), zie stap 7.
2. Pas de parameters van de vries-droogproces zodat de temperatuur van het monster steeds beneden de Tg van het monster en de kamerdruk maakt een snelle sublimatie van ijs, dat wil zeggen primair drogen en restwater in de formulering, dat wil zeggen secundaire drogen. Indien de monstertemperatuur boven Tg 'tijdens het droogproces er een groot gevaar voor instorting van het monster die de cellulaire overleving significant kan verminderen.
3. Om de droge producten te beschermen na freeze drogen het monster atmosfeer worden gecontroleerd. Indien mogelijk, sluit de monsters in de vriesdroger voordat het vacuüm wordt vrijgegeven op het einde van de vriesdrogen cyclus. Ook de flesjes gevuld kan worden met een gewenste atmosfeer. Het is belangrijk om blootstelling van de monsters aan de omgevingsomstandigheden voor vocht of zuurstof in de bewaaratmosfeer de overleving van cellen beïnvloeden.
4. Weeg de flesjes.

5. Rehydratie

1. Hydrateren de monsters met gedeïoniseerd en steriel water. De hoeveelheid water die moet worden toegevoegd dat dient met het bedrag verwijdert tijdens vriesdrogen en wordt berekend uit het gewicht van de lege flacon, hetzelfde flesje met monster voor en na vriesdrogen zijn. Vortex de monsters nu en dan weer tot de oplossingen verschijnen homogeen.

6. Opsomming

1. Trekken 100 pi van elk monster en maak 10-voudige seriële verdunningen. Uit de verdunningen van inteoverige 100 ul wordt uitgeplaat op TSA-platen. De platen worden geïncubeerd bij de temperatuur en tijd vereist.

7. Karakterisering van Formulering van Freezing Gedrag

1. Neem een ​​kleine hoeveelheid, 5-10 mg, van het monster en het insluiten in een DSC-aluminium pan met deksel. Bereid een lege pan als referentie.
2. Stel de DSC temperatuur scanprogramma. De koel-programma is ingesteld op de bevriezing stap in het vriesdrogen programma na te bootsen. Dit gebeurt als koelmiddel kinetiek beïnvloeden de Tg 'van de gehydrateerde samenstellingen. Vóór de verwarmingsscan begint omlaag brengen van de temperatuur ruim onder de verwachte Tg 'van de onderzochte formuleringen, gewoonlijk -100 ° C.
3. Kies een geschikte opwarmsnelheid, normaal gesproken een opwarmsnelheid van 5 - 40 ° C / min wordt gebruikt. De opgenomen warmte stroomsignaal wordt uitgedrukt in watt en wordt beïnvloed door de verwarmingssnelheid. Een hogere verwarming tarief zal een groter signaal van Tg 'te geven.
4. Stel het temperatuurbereik, zodat ikt omvat zowel Tg en het smelten van de formulering.

8. Surface Tension Metingen van de gehydrateerde formuleringen

1. De experimentele opstelling die in dit experiment wordt volgens de methode du Nouy oppervlak meten.
2. Reinig de platina ring en het meetvat zorgvuldig. Het vat wordt gespoeld met aceton, veegde met een niet-pluizende tissue, en vervolgens verbrand aan de binnenkant met een kleurloze vlam. De ring gloeit rood in een kleurloze vlam.
3. Vul het vat met de oplossing en laat het oppervlak af te wikkelen alvorens te meten. Voor oplossingen waarbij de evenwichtstoestand wordt pas na een lange tijd, bijvoorbeeld polymeren, de eenvoudige installatie Daarbij zal worden kwalitatieve gegevens.
4. Voor formuleringen met hoge viscositeiten, zoals oplossingen van 2% (w / w) HEC of HPMC, de oppervlaktespanning te meten aan oplossingen van lagere concentraties worden geëxtrapoleerd. Dit kan gedaan worden door te profiteren van het feit datde daling oppervlaktespanning afvlakt bij concentraties onder 0,5% (w / w).

9. X-ray analyse van de droge formuleringen

1. Neem een ​​kleine hoeveelheid van de matrix / bacteriën en te laden op een monsterhouder.
2. Monteer de monsterhouder in de X-ray-diffractometer.
3. Om kristallijne fase in het monster analyseren de EVA programmapakket van Bruker worden gebruikt.

10. Electron Microscopy

1. Neem een ​​kleine hoeveelheid van de matrix / bacteriën uit de flesjes en plaats deze op een SEM stomp.
2. Laad de SEM houder in het sputter-bekleder (Thermo VGScientific Polaron SC7640 gebruikt in het huidige werk) en de vacht van de steekproef met een paar nm van Au / Pd of Pt. In deze experimenten werden de sputteren parameters: 1900 V, 20 mA en 20 sec, voor een ~ 5-10 nm Au / Pd coating. De coating vermindert elektrische oplading tijdens beeldopname. Het wordt aanbevolen om te beginnen met een dunne laag en, indien opladen voortduren veroorzaakt imageartefacten, moet het monster opnieuw worden gecoat.
3. Laad de SEM houder in de SEM kamer. Selecteer de juiste beeldvorming parameters. Voor het instrument gebruikt in figuur 2 (FEI Strata DB235) gebruikten we 5 kV versnellingsspanning, spotsize 3, een werkafstand van 5 mm en de secundaire elektronen detector.
4. Eventueel is het mogelijk om de Focused Ion Beam dwarsdoorsneden van de bacteriën in het polymeer ingebedde voor verdere details onthullen snijden.

Representative Results

Tabel 1 toont gegevens formulering samenstelling, thermische gebeurtenissen DSC opgenomen tijdens het verwarmen van de bevroren samenstellingen, structuur van de droge monsters en de oppervlaktespanning van de formulering oplossingen. De _Tg 'van sacharose is bepaald -40 ° C ^{2, 3} en kan moeilijk te detecteren sucrose concentraties beneden 20% w / w. De thermische gebeurtenis bij -35 ° C houdt waarschijnlijk verband met het ontstaan ​​van ijs oplossing ^2. De kristallijne structuur gedetecteerd door X-ray in de HEC en HPMC monsters en ook gezien in SEM (zie figuur 2b en 2c) overlappen de normale kristalvorm van NaCl.

Figuur 1A toont de overleving gegevens voor de Gram-negatieve P. putida en de Gram-positieve A. chlorophenolicus geformuleerd in verschillende saccharide gebaseerde formuleringen. Merk op dat de trend in hoe goed de formuleringen steunen overleving van de cel is hetzelfde voor both bacteriesoorten. De in figuur 1B plot toont de correlatie tussen het vriesdrogen overleving en de oppervlaktespanningen van de formuleringen.

Figuur 2 toont SEM-beelden van de droge formuleringen. Voor de vier polymeren hier getoond, de matrix gevormd heeft het uiterlijk van "scherpe paper": onderling verbonden soepele bladen waarin de bacteriën zijn ingebed en te zien zijn als golvingen. Voor Ficoll en sucrose, de platen zijn ongeveer 1 micrometer dik en 10 - 20 micrometer breed, met Ficoll met een gladder oppervlak. HPMC en HEC vormen veel dunnere platen, mogelijk als gevolg van het feit dat de hoeveelheid polymeer minder deze cellulose-gebaseerde formuleringen dan in de andere (tabel 1). Bovendien werden zoutkristallen waargenomen voor HEC en HPMC, waarbij de laatste met een grotere hoeveelheid neerslaat op het oppervlak van het polymeer vellen. Bacteriën zijn beter te zien in de cellulose gebaseerde formuleringen omdat de platen steinnerlijke. In sucrose en Ficoll, zijn ze meestal waargenomen als golving van de anders gladde oppervlakken.

Formulering samenstelling	Thermische gebeurtenissen gedetecteerd in bevroren formuleringen	Structuur van droge formulering	Oppervlaktespanning van gedroogd formuleringen (mN m -1)
10% Sucrose	ontstaan ​​van ijs ontbinding, -35 ° C	amorfe sucrose	72 ± 0.1
10% Ficoll, 150 mM NaCl	Tg ', -22 ° C	amorfe Ficoll	68 ± 0.3
2% HEC, 150 mM NaCl	eutectische smelten van ijs en NaCl, -28 ° C	amorfe HEC, kristallijn NaCl	64 ± 0,6
2% HPMC, 150 mM NaCl	eutectische smelten van ijs en NaCl, -27 ° C	52 ± 0.8

Tabel 1. De samenstelling van de verschillende samenstellingen en eigenschappen van de waterige of droge formuleringen. Het polymeer concentratie van de HEC en HPMC werden gemaximaliseerd een dik genoeg matrix dekking van de bacteriën bewerkstelligen, maar nog steeds een werkbare oplossing ten aanzien van de viscositeit.

Figuur 1. A) Overleving van gevriesdroogde P. putida (wit) en A. chlorophenolicus (grijs) wanneer geformuleerd in oplossingen gebaseerd op de disaccharide sucrose of de polymeren Ficoll, HEC en HPMC, B) Correlatie tussen celoverleving na vriesdrogen en de oppervlaktespanning van de niet-gedroogde preparaten.

Figure 2. SEM beelden van P. putida in vier verschillende formuleringen: a) sucrose, b) Ficoll, c) HEC, d) HPMC. De bacteriën zijn moeilijk te zien in a) en b) omdat de polymère vel zijn vrij dik en kunnen de bacteriën volledig omhullen, in c) en d) de bacteriën weergegeven hoger op het oppervlak. In d), kunnen zij worden onderscheiden van de grote hoeveelheid zout slaat vanwege hun vorm en contrast, zoals deze als langwerpige, donker bloedlichaampjes.

Discussion

De aanleiding voor dit onderzoek was om enkele formulering eigenschappen die van belang kunnen zijn voor de overleving van de cel tijdens vriesdrogen onderzoeken. Hoewel de intrinsieke drogen zekere tolerantie tussen verschillende soorten, zoals geïllustreerd in figuur 1A, de trend van hoe goed de verschillende formuleringen support celoverleving is vergelijkbaar. Het is informatief te beginnen met een vergelijking van sucrose en Ficoll. Er wordt aangenomen dat een belangrijke factor voor een formulering celoverleving steunen is het vermogen van de formulering ingrediënt (en) tot water vervangen tijdens uitdroging, waardoor de structuur van de eiwitten en membranen van de cel ook in droge toestand handhaven. Disacchariden zoals sucrose, maar ook trehalose tonen deze eigenschap, terwijl polymeren zoals de polysaccharide zetmeel niet ^5,11. Polymeren als te groot om met de membraanlipiden op dezelfde manier als disachariden. Een andere belangrijke eigenschap voor een succesvolle vriesdrogening van micro-organismen is het vermogen van de ondersteunende matrix te verglazen (dwz. worden amorfe vaste stoffen) tijdens vriesdrogen. De amorfe structuur is gunstig voor de afscherming en het houden van cellen gescheiden. Interessant is dat zowel disacchariden en polymeren gemakkelijk verglazen als het vriesdrogen behoren wordt uitgevoerd. Onze resultaten tonen aan dat zowel sucrose en Ficoll formuleringen worden amorfe na vriesdrogen, zie tabel 1 en ondersteuning celoverleving even goed. Er zijn significante verschillen tussen de twee sacchariden. In tegenstelling tot sucrose, de Ficoll molecuul met een molecuulgewicht van 400 kDa, te groot om water te vervangen in de interactie met lipide membranen tijdens vriesdrogen ^{4, 5.} Zoals de Ficoll moleculen worden uitgesloten van de periplasmatische ruimte van Gram negatieve bacteriën, wederom vanwege hun omvang ^6, cellulaire opname van Ficoll onwaarschijnlijk. Op basis hiervan stellen wij voor dat het beschermende effect bepaded door de sucrose formulering is niet in de eerste plaats te wijten aan cellulaire opname van de disaccharide, belangrijk voor water vervangen capaciteit van intracellulaire structuren ^{7, 8.} Integendeel, het vermogen van Ficoll om celoverleving ondersteuning heeft met eigenschappen die zowel de Ficoll en sucrose formulering, zoals de amorfe structuur.

Gericht op de polymeren, blijkt uit figuur 1A die het vermogen van het polymeer formuleringen celoverleving steunen varieert. De X-stralen analyse toonde aan dat NaCl gekristalliseerd tijdens vriesdrogen en bestond naast de anders amorfe structuur van de HEC en HPMC formuleringen. Geen kristallijn materiaal werd gedetecteerd in de Ficoll preparaat. NaCl kan complexen vormen met de hydroxylgroepen in koolhydraten ^{9, 10.} In Ficoll en HEC-gebaseerde formuleringen het NaCl te hydroxylrest molverhouding was 1:11 en 1:01, respectievelijk, uit te leggen waarom er geen kristallisatie werd gedetecteerdin de Ficoll-preparaat. De fasescheiding tussen NaCl en cellulose polymeren werd ook waargenomen in de DSC-onderzoeken. Een eutectische smelt werd opgenomen tijdens het verwarmen van het bevroren HEC en HPMC-preparaten geven dat de fasescheiding plaatsvindt in de bevroren toestand. De morfologie en microstructuur van het preparaat blijkt uit SEM beelden (figuur 2) en bevestigt de DSC röntgengegevens. Bacteriële cellen uit steekt de platen met afgezette NaCl kristallen duidelijk op het oppervlak van de HEC-sheets. Op basis van de overeenkomst tussen de overlevingskansen van bacteriën geformuleerd in de HEC-oplossing en Ficoll-oplossingen in vergelijking met HPMC concluderen we dat de toestand van het zout, hetzij gedispergeerd als kristallen of opgelost in het polymeer, niet correleert met celoverleving. In plaats celoverleving toont een relatie met de oppervlaktespanning van de samenstellingen, zie figuur 1B. Voor lagere oppervlaktespanning, lower overlevingskansen worden opgenomen voor de bacteriën. Merk echter op dat de gemeten oppervlaktespanning wordt de wisselwerking tussen de opgeloste stoffen, namelijk sucrose en de polymeren en het oplosmiddel molecuul. Toch maakt een indirecte speculatie oppervlakteactiviteit van polymeren kan worden gerelateerd aan hun neiging om ook interactie met celoppervlakken een destabiliserende wijze. Als de concentratie van de opgeloste stoffen toeneemt tijdens bevriezen, kan de negatieve effecten versterkt worden uitgelegd waarom de negatieve gevolgen van de oppervlakte actieve polymeren werden niet waargenomen wanneer alleen het opslaan van bacteriën in de volledig hydraterende samenstellingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.