Summary
Флуоресцентный
Abstract
Адгезия Plasmodium тропической инфицированных эритроцитов (IE) в человеческих эндотелиальных рецепторов во время заражения малярией при посредничестве выражения PfEMP1 вариантов белка, кодируемого VAR генов.
Гаплоидный P. тропической таит в геноме около 60 различных вар генов, из которых только один был Считается, что транскрибируется в камере в то время, в течение кровью стадии инфекции. Как такие взаимоисключающие регулирования VAR транскрипции генов достигается неясно, как это идентификация отдельных генов или VAR подгруппы VAR генов, связанных с различными рецепторами и следствие дифференциальной обязательными для клинического исхода П. тропической инфекции. В последнее время взаимоисключающие парадигмы транскрипции была поставлена под сомнение транскрипции анализы, основанные на отдельных P. тропической стенограммы идентификации в разовыхected эритроцитарных клеток с помощью РНК-флуоресцентной гибридизации (FISH) анализ VAR транскрипции генов паразита в отдельных ядер P. тропической IE 1.
Здесь мы представляем подробный протокол для проведения РНК-FISH методологии анализа VAR транскрипции генов в одно-ядрах P. тропической инфицированных эритроцитов человека. Метод основан на использовании дигоксигенином и биотин-меченых зондов антисмысловой РНК помощью TSA Plus флуоресценции Палитра Система 2 (Perkin Elmer), микроскопические анализы и недавно выбранный P. тропической IE. На месте методом гибридизации может быть использован для контроля транскрипции и регулирования различных генов, выраженных в ходе различных этапов P. тропической жизненного цикла и может быть адаптирована к другим малярийных паразитов рыб и других организмов и типов клеток.
Protocol
1. Генерация Свежий Выбранный зараженных эритроцитов
Для этого теста, лучшие результаты получаются при использовании культур недавно выбранных для поверхностного выражения PfEMP1 белка. В данном эксперименте 3d7 P. тропической линии был выбран с помощью специфических антител, как описано ранее 1.
День 1
- Урожай 200 мкл упакованных клеток крови из P. тропической культуры, содержащие 2-5% в конце IE этапе путем центрифугирования при 800 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре.
- Повторное приостановить кровь гранул в 2 мл 37 ° C теплый 0,75% раствор желатина в 14 мл стерильной пробирке, и оставить на 15-20 мин при 37 ° C, чтобы неинфицированных и кольцо стадии IE в осадок.
- Урожай поздних стадиях IE, то есть верхнюю фазу, в новый 14 мл трубки и мыть два раза по 10 мл 37 ° C теплый РБК-стирка СМИ.
- Развести 50 мкл специфических анти-PfEMP1 антител в 2 мл 37 ° С теплыми РБК-стирка средствами массовой информации и стерильный фильтр.
- Смешать промытый поздней стадии IE с стерилизованное разбавленный антисыворотки в 14 мл стерильной пробирке и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C при осторожном перемешивании.
- Спином вниз на 800 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре, и мыть два раза по 10 мл 37 ° C теплый РБК-стирка СМИ.
- Вымойте 50 мкл Dynabead белка подвеска дважды РБК-стирка массовой информации, использующих DynaMaq-15 магнита.
- Ресуспендируют Dynabeads в 300 мкл РБК-стирка СМИ и добавить их в промытую поздней стадии IE. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C при осторожном перемешивании.
- Передайте трубку к DynaMaq-15 магнита. Оставьте на 1-2 минут и удалить все жидкости.
- Ресуспендируют Dynabeads в 4-5 мл РБК-стирка СМИ. Передайте трубку обратно на магните и оставьте на 1-2 минут, прежде чем снимать всю жидкость. Повторите стадии промывки один раз.
- Передача промытый бусины на 25 см 2 стерильных F культурыласк, содержащие 200 мкл свежей эритроцитарной массы. Добавить 5-6 мл Albumax средств массовой информации в культуре. Хранить в течение ночи при 5% CO 2 при 37 ° C.
День 2
- Снимите Dynabeads от культуры, когда выбран ИЭ reinvaded свежие эритроциты, передав все культуры в 14 мл стерильной пробирке. Положите трубку на DynaMaq-15 магнита и оставить на 1-2 мин. Затем залить все жидкости обратно в колбу культуры.
- Культура как для нескольких циклов насколько возможно, пока паразитемии 5-10% и паразиты находятся в ringstage.
- IE должны быть проанализированы FACS, чтобы убедиться, что правильный фенотип поверхности, т.е. экспрессия белка либо and/orPF11_0008 PFD1235w был получен 1.
2. Подготовка зонды
Антисмысловую РНК-зондов были получены из самых разнообразных регионов PFD1235w и PF11_0008 VAR </ EM> генов из P. тропической 3d7 геномной ДНК. ДНК амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в pSPT18 или 19 вектор для транскрипции, соответственно, по описанию производителя (Roche). Зондов (580 пар оснований (п.о.) и 590 б.п. в длину) были помечены дигоксигенин (DIG) или биотин помощью DIG РНК маркировки Kit или биотин РНК маркировки Mix, соответственно. Мы подтвердили специфичность проб и анализов на Северном пятно и одной меткой FISH анализа 1.
3. Тонкий мазок и фиксации Паразиты До в гибридизация
День 1
Все действия выполняются в РНКазы окружающей среды и все реагенты РНКазы или предварительно обрабатывают диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) или РНКазы Зап (Invitrogen). Слайдов и покровные стекла должны быть очищены спиртом для удаления остатков смазки производства. Важно, чтобы выполнить протокол без паузы между шагамиВ целях сведения к минимуму риска загрязнения нуклеазы.
- Сделать тонкой пленкой крови стандартным методом распространения 3. Использование 100x объектива нефти микроскопом, подсчитать IE и расчета доли IE в культуре. Проверьте, что паразит этапов в приближенных синхронно, в кольце и в начале Трофозоита этапах IE цикла. Таковы предварительные репликации, одно-пузырькового стадии, выражая VAR мРНК гена и подходит для одной ячейки FISH транскрипции анализа этого типа.
- Передача 50 мкл культуры паразита, на паразитемии на 5-10%, до 1,5 мл РНКазы трубки Эппендорф. Центрифуга течение 1 мин при 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре.
- Удалить СМИ и добавить 50 мкл PBS рН 7,2 в DEPC обработанной воды. Перемешивать трубку осторожно. Повторите шаг центробежного осаждения в два раза мыть клетки свободны от средств массовой информации и остатков клеток.
- Сделайте четыре хорошего качества тонких мазков. Для каждого мазка, сделайте один мазок наодин 11 мм в диаметре скважины 4 хорошо слайд, то есть четыре стеклянные слайды в общем, в РНКазы капот (критический шаг). Волна скользит кратко в воздух, чтобы высохнуть. Сделайте три дополнительные слайды для отрицательного контроля одного слайда для одного окрашивания зонд для любой другой ген имеет значения с использованием специального зонда, другой слайд для РНКазы лечение и третий слайд, содержащий IE не выражал интерес гена. Оставьте слайды для просушки на скамейке в течение 10-20 мин.
- Исправить тонких пленок путем добавления 60 мкл фиксации раствор, содержащий 4% параформальдегида и 5% ледяной уксусной кислоты в скважинах. Оставьте на 10 минут на скамейке при комнатной температуре.
- Вымойте слайды в 2x ГНПП буфера в течение 5 минут на легком перемешивании при комнатной температуре. Коротко удаления избытка жидкости, касаясь лунки, содержащие клетки осторожно салфеткой.
- Накройте слайды с 0,01% пепсина в 0,01 М HCl в течение 2 мин при 37 ° C (чрезвычайно важный шаг). Вымойте слайды в 2x ГНПП течение 5 мин при комнатной температуре.
- Разведите раствор РНКазы до конечной концентрации 10 мкг / мл. Накройте отрицательных мазков управления с 60 мкл раствора РНКазы. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C, а затем вымыть слайды в 2x ГНПП течение 5 мин при комнатной температуре.
- Немедленно приступить к гибридизации шаг.
4. Гибридизация РНК-зондов для фиксированного Слайды
День 1
- Подготовка гибридизации камеры, такие как Thermostar 100 HC4 или пустую коробку кончика пипетки помещают в чистую печь, путем распыления с РНКазы Зап и вытирая его в чистоте с бумажной ткани. Заполните каналы камеры гибридизации или в нижней части коробки с DEPC обработанной воды, чтобы убедиться, что слайды не будут высыхать при гибридизации. Закройте камеру и разогрейте до 48 ° C.
- Развести зонды в гибридизации решение конечной концентрации 12 нг / мкл. Денатурации зонд раствора при 65 ° C в течение 5 мин в нагревательный блок. Немедленно охладить на льду.
- Коротко сухой воздух слайды после стирки 2x ГНПП. Аккуратно удалите лишнюю жидкость вокруг скважины с бумагой.
- Откройте гибридизации камеру и поместить слайды в камере. Применение одного или обоих зондов в общем объеме 60 мкл на лунку. Осторожно покрытия капли жидкости с РНКазы покровного стекла с использованием стерильных щипцов.
- Закройте камеру и гибридизуется слайды при 48 ° C в течение не менее 16 часов в течение ночи.
5. Сопряжение антител и флуоресцентного усиление
День 2
Следующие шаги основаны на TSA Plus флуоресценции Палитра системы от Perkin Elmer. Все действия выполняются при комнатной температуре.
- Вымойте слайды 3 раза в буфере TNT в течение 5 мин при осторожном перемешивании.
- Блок скважины в 150 мкл буфера TNB в течение 30 мин.
- Развести HRP-конъюгированных α-DIG антител в буфере TNB в соотношении 1:100 и HRP-конъюгированных α-биотина антител в буфере ТНБ, в соотношении 1:500. Удалите излишки буфера TNB из слайдов с бумагой. При обнаружении двух транскриптов одновременно, как антитела могут идти одновременно. Нанесите на общую сумму в 100 мкл антитела TNB раствора на хорошо и тщательно накрыть крышкой скольжения. Инкубируйте слайды в течение 2 часов.
- Снимите крышку скользит внимательно. Вымойте слайды в буфере TNT 3 раза в течение 5 мин.
- Развести FITC-флуорофора в tyramide реагента усиления в соотношении 1:500 и применять по 100 мкл раствора в каждую лунку. Накройте крышкой скважин с промахами и инкубировать в течение 12 мин.
- Снимите крышку скользит тщательно вымыть и слайды 3 раза в течение 5 мин в буфере TNT нежным агитации.
- Развести Cyan3-флуорофора в tyramide реагента усиления в соотношении 1:500. Добавить 100 мкл наа этого решения. Накройте крышкой скважин с промахами и инкубировать в течение 12 мин.
- Снимите крышку скользит внимательно, а затем промыть слайды быстро путем погружения в буфере TNT.
- Вымойте слайды 3 раза TNT буфера в течение 5 мин.
- Погрузитесь слайды быстро DEPC обработанной воды.
- Оставьте слайды высохнуть на воздухе. Установите слайды с анти-Fade реагентом, содержащим DAPI. Печать по углам крышки скользит с лаком для ногтей.
- Слайды готовы для микроскопии. Держите горки покрыты алюминиевой фольгой и хранить при 4 ° C, если эксперимент будет завершен на следующий день. Полная герметизация стороны слайдов может быть осуществлена через 24 часа после применения анти-Fade реагента. Это позволит слайдов, чтобы быть отображена на срок до одной недели после того, как протокол был завершен.
6. Визуализация гибридизированных зонды
- Включите микроскопом. Стандартные иммунофлюоресценции микроскоп sufficдиентом для такого эксперимента, но если у вас есть доступ к конфокальной микроскопии Вы также можете использовать это для 3D-изображений или для получения видео из ваших окрашенных клеток. Разрешить микроскоп, чтобы прогреться в течение 15-30 мин. Включите компьютер и программное обеспечение.
- Проверьте качество окраски на иммунофлюоресценции микроскопом. Выберите место, содержащий несколько паразитов.
- Регулировка усиления каждого лазерного вручную. Отрегулируйте пикселей жить до 4-6 м -1 с -1 и шаги, до 512 х 512 пикселей.
- Пройти тест изображения с помощью кадров Lambda. Отрегулируйте усиления лазера.
- Возьмите как минимум 20 хороших фотографий люминесцентных отдельных клеток. По крайней мере, 2-5 фотографий поле, содержащее 5-20 паразитов необходимы для того, чтобы получить справедливую обзор процент положительных паразитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана блок-схема основных этапов и длительности методологии FISH РНК.
Серия представитель изображениями хорошо, и плохо сохранившиеся окрашенных экспериментов FISH мРНК с использованием одной P. тропической IE показано на рисунке 2. Это внутриклеточные простейшие имеет небольшой (1-1.5 мкм в диаметре) ядром которого окрашен в голубой цвет с DAPI. Двадцать четыре часа после вторжения в эритроцитах P. тропической процесс шизогонии, т.е. ядерное деление, начинается. Оптимальное обнаружение рыбы VAR транскрипции генов происходит на уровне около 10-22 часов в этом 48 час внутри эритроцитов литического цикла. Зонды вообще гибридизуются видов мРНК, которые появляются рядом с главным ядерным тела, в том, что, вероятно, ядерная оболочка связанных эндоплазматической сети. Хорошее качество изображения в строке шоу-FITC (зеленый) и Cyan3-(красный) меченых зондов соответствующие PFD1235w и PF11_0008 VAR гены, соответственно, в двойном выбран P. тропической к югу от линии, 3d7 PFD1235w/PF11_0008. Сотрудничество локализации генов, очевидно, но не абсолютным. Ряд B показывает плохие гибридизации обоих зондов к паразитам, которые либо деградировали или в значительной степени перестала расшифровки VAR мРНК. В строке C, хорошо гибридизации рыб получены, но сотовые сохранение плохой, как показано плохо распространяться и агрегирования паразитов.
Рисунок 1. РНК FISH эксперимент блок-схемы. Блок-схема иллюстрирует основные пункты и сроки проведения FISH процедуры.
Рисунок 2. Конфокальной изображения РНК-FISH в двойном выбран P. тропической указывает simultanous мРН.А. транскрипции двух различных генов VAR обозначалась либо с FITC (зеленый) или Cyan3 (красный) сигнал. Окрашивание DAPI (синий) указывает паразиты ядерной ДНК. Вертикальный ряд A1, B1 и C1 показать передачу изображения паразитов. Шкала бар 5 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
РНК FISH анализ, в отличие от методов, таких как Северная блоттинга и RT-PCR, позволяющий дискриминации конкретных транскриптов мРНК на одном уровне клетки. Это позволяет различать транскрипционно активные и неактивные клетки, в данном примере, P. тропической паразитических простейших человека внутри красных кровяных клеток. Такие цельноклеточной наблюдения часто необходимы и могут разгадать важных и новых транскрипционных модели 1.
Хотя другие рыбы РНК методы были описаны 4-10, было необходимо для развития новых и изысканных протокол для изучения одновременного VAR транскрипцией мРНК в P. тропической. С помощью зондов асРНК как средства обнаружения, специальные временные паттерны активности мРНК могут быть легко локализована в клетках. Кроме того, асРНК датчики также могут быть использованы в других экспериментальных систем, которые будут поддерживать их специфичности 1. Другие критческих параметров, которые важны при разработке нового протокола включает в себя фиксацию и permeabilzation клеток. Эти шаги были эмпирически определить путем тестирования различных химических реагентов, как это было предложено других авторов 5. Мы пришли к выводу, что, объединив медленно действующий параформальдегида крест компоновщик вместе с коагулянтом фиксатором уксусной кислоты мы могли бы получить хорошую сохранность тканей морфологии. Кроме того, мы узнали, что предварительного блокирования клетки перед добавлением зондов не было необходимости, как и в других описанных РНК FISH протоколов 5. Кроме того, в настоящем протоколе мы используем нежно моет, мягкий протеазы (пепсин) при низких объемах и короткий инкубационный период, чтобы обеспечить зонда и антител к диффундировать в ядро и гибридизации с мРНК крепится на ER, сводя к минимуму повреждения окружающих мембраны (рис. 2A1-2A4).
Кроме того, рыба РНК и изображений с высоким разрешением порожденных ВерблюдПрилагаемый к конфокальной микроскопии показывает, является ли конкретная ячейка является позитивной для окрашивания или нет, а также дает ценную информацию о пространственных отношениях между окрашенных антисмысловых РНК и ядра окрашенных DAPI. Как решить в изображениях на рис 2A4, мРНК, по-видимому, придает рядом с ядром, вероятно, в эндоплазматической сети, а не на нем, как ожидается, в ДНК-FISH изображений 11-12.
Исследование одиночных камерах наблюдения требуют многочисленных паразитов и в различные моменты времени, чтобы получить статистически значимый результат. Таким образом, РНК FISH анализ является довольно трудоемкой техникой, которая требует терпения и значительных экспериментов методом проб и ошибок, чтобы откалибровать технику. Как РНК рыбы Техника многим параметрам по устранению неисправностей на основных этапов этого протокола приведены в таблице 1.
| Проблема | Возможные осторожностьюЮ-В | Рекомендация |
| Слабый сигнал или нет сигнала |
|
|
| Плохо сотовой сохранения |
|
|
| Высокий фон |
|
|
| РНКазы лечение управления положительно |
|
|
| Ложное срабатывание обнаружения отрицательного контроля паразитов |
|
|
Таблица 1. Troobleshooting руководства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Майкла Alifrangis и Улла Abildtrup для генотипирования паразитов и Кристина Holm за отличную техническую помощь. Эта работа финансировалась Медицинского института Говарда Хьюза (грант 55005511), Lundbeck фонда (грант R9-A840) и Нильс Бор Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
| Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
| Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate 50 ml Albumax-solution |
| Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
| Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
| Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640 Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
| Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
| Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
| Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
| Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
| Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
| culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
| DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
| Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
| Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
| Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
| Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
| Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt's 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
| Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
| Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
| Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
| Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
| Nailpolish | Available in any drugstore | ||
| PBS 20x:NaCl KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
| Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
| Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
| Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
| RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
| RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
| RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
| RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
| RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
| Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
| SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
| SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
| SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
| TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
| TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
| TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
| TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
| TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
| TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
| Tubes 14 ml sterile | Almeco - CM LAB Aps | 91016 |
References
- Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
- Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
- Cheeseborough, M. District Laboratory Practice in Tropical Countries. , Cambridge University Press. Cambridge. (2006).
- Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites. Genome Biol. 10, R117 (2009).
- Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum. RNA. 15, 116-127 (2009).
- Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites. Cell. 121, 25-36 (2005).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).
- Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin. J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).
- Thompson, J., Sinden, R. E. In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei. Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).
- Thompson, J. In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites. Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).
- Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony. Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).
- Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).
