Флуоресцентный<em> На месте</em> Гибридизации (FISH) для выявления транскриптов мРНК в отдельных клетках позволяет провести анализ полигенных деятельности, такие как одновременное транскрипции более чем одного члена<em> Var</em> Мультигенного семьи в<em> Plasmodium тропической</em> Инфицированных эритроцитов<sup> 1</sup>. Этот метод является гибкой и может быть использована на различные типы генов, клеток и организмов.
Адгезия Plasmodium тропической инфицированных эритроцитов (IE) в человеческих эндотелиальных рецепторов во время заражения малярией при посредничестве выражения PfEMP1 вариантов белка, кодируемого VAR генов.
Гаплоидный P. тропической таит в геноме около 60 различных вар генов, из которых только один был Считается, что транскрибируется в камере в то время, в течение кровью стадии инфекции. Как такие взаимоисключающие регулирования VAR транскрипции генов достигается неясно, как это идентификация отдельных генов или VAR подгруппы VAR генов, связанных с различными рецепторами и следствие дифференциальной обязательными для клинического исхода П. тропической инфекции. В последнее время взаимоисключающие парадигмы транскрипции была поставлена под сомнение транскрипции анализы, основанные на отдельных P. тропической стенограммы идентификации в разовыхected эритроцитарных клеток с помощью РНК-флуоресцентной гибридизации (FISH) анализ VAR транскрипции генов паразита в отдельных ядер P. тропической IE 1.
Здесь мы представляем подробный протокол для проведения РНК-FISH методологии анализа VAR транскрипции генов в одно-ядрах P. тропической инфицированных эритроцитов человека. Метод основан на использовании дигоксигенином и биотин-меченых зондов антисмысловой РНК помощью TSA Plus флуоресценции Палитра Система 2 (Perkin Elmer), микроскопические анализы и недавно выбранный P. тропической IE. На месте методом гибридизации может быть использован для контроля транскрипции и регулирования различных генов, выраженных в ходе различных этапов P. тропической жизненного цикла и может быть адаптирована к другим малярийных паразитов рыб и других организмов и типов клеток.
РНК FISH анализ, в отличие от методов, таких как Северная блоттинга и RT-PCR, позволяющий дискриминации конкретных транскриптов мРНК на одном уровне клетки. Это позволяет различать транскрипционно активные и неактивные клетки, в данном примере, P. тропической паразитических простейших…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Майкла Alifrangis и Улла Abildtrup для генотипирования паразитов и Кристина Holm за отличную техническую помощь. Эта работа финансировалась Медицинского института Говарда Хьюза (грант 55005511), Lundbeck фонда (грант R9-A840) и Нильс Бор Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution |
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution |
Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
Hybridization solution: Denhardt’s 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt’s 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
Nailpolish | Available in any drugstore | ||
PBS 20x:NaCl
KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4
160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
Tubes 14 ml sterile | Almeco – CM LAB Aps | 91016 |