Floresan<em> In situ</emBireysel hücrelerde mRNA transkriptleri tanımlamak için> hibridizasyon (FISH) bu tür birden fazla üyesinin eşzamanlı olarak transkripsiyon aktivitesi polijenik analizinin yapılmasını mümkün kılar<em> Var</em> Multigen aile<em> Plasmodium falciparum</em> Enfekte eritrositler<sup> 1</sup>. Bu teknik uyarlanabilir ve genler, hücreler ve organizmalar farklı türlerde kullanılır.
Sıtma enfeksiyonları sırasında insan endotel reseptörlerine Plasmodium falciparum enfekte eritrositler (IE) Yapışma var genler tarafından kodlanan PfEMP1 protein varyantları ifade aracılık etmektedir.
Haploid P. falciparum genom tek bir enfeksiyonun kan aşaması sırasında her defasında hücre başına transkribe olduğu düşünülmektedir edilmiş olan yaklaşık 60 farklı var genler barındırır. Nasıl var gen transkripsiyonu gibi birbirini dışlayan düzenleme elde edilir belirsizdir, bireysel var genleri veya P. klinik sonuçlar üzerinde farklı reseptörleri ve diferansiyel bağlama sonucu ile ilişkili var genlerin alt gruplarının tanımlanmasıdır falciparum enfeksiyonlar. Son zamanlarda, birbirini dışlayan transkripsiyon paradigması bireysel P. esas transkripsiyon analizleri ile şüphe içine adı olmuştur Tek inf içinde falciparum transkript tespitiP. bireysel çekirdeklerinde parazit var gen transkripsiyonu in situ hibridizasyon RNA floresan kullanarak ected eritrotik hücreleri (FISH) analizi falciparum IE 1.
Burada, P. tek-çekirdekleri var in gen transkripsiyonu analizi için RNA FISH yöntemi gerçekleştirmek için bir protokol ayrıntılı sunmak falciparum insan eritrosit etkilemiştir. Yönteminin kullanımını esas digoxigenin-ve TSA Artı Flüoresans Palet Sistemi 2 (Perkin Elmer), mikroskopik analiz ile taze seçilmiş S. antisens RNA probları kullanılarak biyotin-etiketli falciparum IE. In situ hibridizasyon metodu ile de P. farklı aşamaları sırasında ifade edilen genlerin transkripsiyonu ve çeşitli düzenleme izlemek için kullanılabilecek falciparum yaşam döngüsü ve diğer sıtma parazit türlerinin ve diğer organizmalar ve hücre tipleri uyarlanabilir.
RNA FISH analizi, bu gibi Northern blot ve RT-PCR gibi yöntemlerin tersine, tek bir hücre düzeyinde spesifik mRNA transkriptlerinin ayrımı izin verir. Bu, P., bu örnekte, bu mümkün transkripsiyonel olarak aktif ve aktif olmayan hücreler arasında ayrım yapan falciparum parazitik insan kırmızı kan hücreleri içinde protozoa. Böyle tam hücreli gözlemler genelde gereklidir ve önemlidir ve roman transkripsiyonel desenler 1 çözülmeye olabilir.
Di?…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar mükemmel teknik yardım için parazit ve Christina Holm genotipleme için Michael Alifrangis ve Ulla Abildtrup teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü (hibe 55005511), Lundbeck Vakfı (hibe R9-A840) tarafından ve Niels Bohr Vakfı tarafından finanse edildi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution |
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution |
Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
Hybridization solution: Denhardt’s 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt’s 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
Nailpolish | Available in any drugstore | ||
PBS 20x:NaCl
KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4
160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
Tubes 14 ml sterile | Almeco – CM LAB Aps | 91016 |