Fluorescent<em> In situ</emHybridation> (FISH) pour identifier des transcrits d'ARNm dans des cellules individuelles permet l'analyse de l'activité polygénique tel que la transcription simultanée de plus d'un membre de la<em> Var</emFamille multigénique> dans<em> Plasmodium falciparum</em> Érythrocytes infectés<sup> 1</sup>. La technique est adaptable et peut être utilisé sur différents types de gènes, des cellules et des organismes.
L'adhérence des érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum (IE) à l'homme récepteurs endothéliaux au cours des infections de paludisme est médiée par l'expression de PfEMP1 variantes de protéines codées par les gènes var.
Le P. haploïde falciparum génome abrite environ 60 différents gènes var dont une seule a été soupçonnés d'être transcrit par cellule à la fois pendant la phase de l'infection du sang. Comment une telle réglementation mutuellement exclusif de la transcription des gènes var est atteint n'est pas claire, ainsi que l'identification des différents gènes var ou sous-groupes de gènes var associés aux différents récepteurs et les conséquences de la liaison différentielle sur les résultats cliniques de P. infections à P. falciparum. Récemment, le paradigme de la transcription mutuellement exclusive a été mise en doute par des essais de transcription individuelle sur la base de P. identification transcription falciparum chez inf uniqueète cellules érythrocytaires en utilisant l'ARN d'hybridation fluorescente in situ (FISH) de la transcription des gènes var par le parasite dans différents noyaux de P. falciparum IE 1.
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la réalisation de la méthodologie ARN-FISH pour l'analyse de la transcription des gènes var dans un seul noyau de P. falciparum infection des érythrocytes humains. La méthode est basée sur l'utilisation de la digoxigénine marqué à la biotine et des sondes d'ARN antisens en utilisant la TSA plus Fluorescence Palette Système 2 (Perkin Elmer), des analyses microscopiques et fraîchement sélectionné P. falciparum IE. Dans le procédé d'hybridation in situ peut être utilisé pour contrôler la transcription et la régulation d'une variété de gènes exprimés au cours des différentes étapes du P. cycle de vie falciparum et est adaptable à d'autres espèces de parasites du paludisme et d'autres organismes et des types cellulaires.
Analyse FISH ARN, contrairement aux méthodes telles que Northern blot et RT-PCR, permet la discrimination des transcrits d'ARNm spécifiques au niveau de la cellule unique. Cela permet de faire la distinction entre les cellules transcriptionnellement actifs et inactifs, dans cet exemple, P. falciparum protozoaires parasites à l'intérieur des globules rouges humains. Ces cellules entières observations sont souvent nécessaires et peuvent percer importantes et nouvelles tendances de la transcription <…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Michael Alifrangis et Ulla Abildtrup pour le génotypage des parasites et Christina Holm pour l'assistance technique excellente. Ce travail a été financé par Howard Hughes Medical Institute (subvention 55.005.511), la Fondation Lundbeck (subvention R9-A840) et par la Fondation Niels Bohr.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution |
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution |
Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
Hybridization solution: Denhardt’s 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt’s 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
Nailpolish | Available in any drugstore | ||
PBS 20x:NaCl
KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4
160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
Tubes 14 ml sterile | Almeco – CM LAB Aps | 91016 |