פלואורני<em> באתר</em> הכלאה (דגים) כדי לזהות תעתיקי mRNA בתאים בודדים מאפשרת ניתוח של פעילות polygenic כגון שעתוק סימולטני של חבר אחד או יותר של<em> Var</em> משפחת multigene ב<em> Plasmodium falciparum</em> אריתרוציטים נגועים<sup> 1</sup>. הטכניקה ניתנת להתאמה, וניתן להשתמש בסוגים שונים של גנים, תאים ואורגניזמים.
הידבקות של אריתרוציטים Plasmodium falciparum הנגועים (IE) לקולטנים אנדותל אדם במהלך זיהומי מלריה מתווכת על ידי ביטוי של PfEMP1 גרסות חלבונים המקודדות על ידי גני var.
הפלואידים פ falciparum הגנום מטפח כ 60 גני var שונים אשר אחד בלבד כבר האמינו שעבד לכל תא בכל פעם בשלב הדם של הזיהום. איך רגולציה סותרת כזה של שעתוק הגנים var מושגת לא ברור, כפי שהוא זיהוי גני var בודדים או תת קבוצות של גנים הקשורים לvar קולטנים שונים והתוצאה של מחייב הפרש בתוצאה הקלינית של פ זיהומי falciparum. לאחרונה, הפרדיגמה שעתוק מוציאות כבר נקראה בספק על ידי מבחני שעתוק המבוססים על פ פרט זיהוי תמליל falciparum בinf אחתתאי האריתרוציטים ected באמצעות רנ"א ניאון כלאה באתר (FISH) ניתוח של שעתוק הגנים var ידי הטפיל בגרעינים בודדים של פ falciparum 1-IE.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע המתודולוגיה RNA-FISH לניתוח של שעתוק הגנים var בגרעינים בודדים של פ falciparum נגוע אריתרוציטים אדם. השיטה מבוססת על השימוש בdigoxigenin וביוטין שכותרתו RNA באמצעות בדיקות antisense TSA פלוס מערכת פלואורסצנטי פלטת 2 (פרקין אלמר), ניתוחים מיקרוסקופים ונבחר טריים פ falciparum IE. בשיטת כלאה באתר ניתן להשתמש כדי לפקח על שעתוק ורגולציה של מגוון רחב של גנים הביע בשלבים השונים של פ מחזור חי falciparum וניתן להתאמה למינים אחרים מלריה טפיל ואורגניזמים אחרים וסוגי תאים.
ניתוח דגי רנ"א, בניגוד לשיטות כמו סופג צפון וRT-PCR, מאפשר אפליה של תעתיקי mRNA ספציפיים ברמת התא הבודדה. זה מאפשר להבחין בין תאי תעתיק פעילים ולא פעילים, בדוגמה זו, פ falciparum הטפיל פרוטוזואה בתוך תאי דם אדומים אנושיים. תצפיות כאלה כל תא הן לעתים הכרחיות ויכולות לחשוף ?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות למיכאל Alifrangis ואולה Abildtrup לgenotyping של טפילים וכריסטינה הולמת לסיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה על ידי הווארד יוז רפואי במכון (מענק 55005511), הקרן לונדבק (מענק R9-A840) ועל ידי נילס בוהר הקרן.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution |
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution |
Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
Hybridization solution: Denhardt’s 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt’s 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
Nailpolish | Available in any drugstore | ||
PBS 20x:NaCl
KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4
160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
Tubes 14 ml sterile | Almeco – CM LAB Aps | 91016 |