השיטה של העברת גנים לעוברי עוף בשלבי דגירה מאוחר יותר (מעל גיל המבורגר המילטון הבמה (ה"ה) 22) מתואר. שיטה זו מתגברת על החסרונות של<em> ב לג'ימי</emElectroporation> להחיל על עוברי תרנגולת מבוגרים היא טכניקה יעילה כדי ללמוד לתפקד גנים ורגולציה בשלבים התפתחותיים מבוגרים.
Abstract
העובר עוף מספקת המערכת מודל מצוין לחקר תפקוד גנים ורגולציה במהלך ההתפתחות העוברית. ב electroporation לג'ימי היא שיטה רבת עוצמה יתר מבטאים גנים חיצוניים או למטה, להסדיר גנים אנדוגניים in vivo עוברי עוף 1. מבנים שונים כגון פלסמידים דנ"א גנים קידוד 2-4, קטן מפריע RNA (siRNA) פלסמידים 5, קטן סינתטי RNA oligos 6, morpholino אנטיסנס 7 ניתן transfected בקלות על ידי electroporation לעוברי עוף. עם זאת, היישום של ב electroporation לג'ימי מוגבל עוברים בשלבים מוקדמים דגירה (צעירים יותר בשלב HH20 – פי המבורג המילטון) 8 ויש כמה חסרונות עבור היישום שלה עוברים בשלבים מאוחרים יותר (מעל גיל הבמה HH22 – כ 3.5 ימים של פיתוח). לדוגמה, קרום vitelline בשלבים מאוחרים יותר הוא usuברית דבק הממברנה יקבע ו פתיחת חלון במעטפת גורמת לקרע של כלי הדם, והתוצאה היא מוות של העוברים, עוברים הבוגרים מכוסים על ידי כלי vitelline ו allantoic, שם קשה לגשת ולטפל בעוברים, עוברים הבוגרים לעבור במרץ קשה לשלוט בכיוון דרך חלון קטן יחסית הקליפה.
בפרוטוקול זה אנחנו מדגימים את השיטה לשעבר electroporation לג'ימי להעברת גנים לעוברי עוף בשלבים המאוחרים (מבוגר בשלב HH22). עבור electroporation לג'ימי לשעבר, עוברים מתורבתים בצלחות פטרי 9 ו vitelline וכלי allantoic מופצים באופן נרחב. בתנאים אלה, העוברים את העוף מבוגרים ניתן לגשת בקלות מניפולציה. לכן, שיטה זו מתגברת על החסרונות של ב electroporation לג'ימי להחיל את עוברי עופות גדולים יותר. באמצעות שיטה זו, פלסמידים ניתן transfected בקלות לחלקים שוניםשל עוברי תרנגולת מבוגרים 10-12.
Protocol
1. אקס לג'ימי תרבות ביציות מופרות טריות מוטלות על הצד הארוך שלהם כפייה טיוטת חממה (BSS160, Ehret, גרמניה) ב 37.5 מעלות צלזיוס עם לחות 60% עבור הדגירה. ביצים המאוחסנים על 12 מעלות צלזיוס במשך שבוע יותר מ 1 אין להשתמש. <li style=";…
Discussion
פרוטוקול זה מספק הוראות להעברת גנים לעוברי עוף מבוגרים (למשל, אל tectum אופטיים ב E6) על ידי electroporation לג'ימי לשעבר. שיטה זו מרחיבה את השימוש electroporation כדי עוברי עוף מבוגרים ניתן ליישם בקלות במעבדות רבות לחקר תפקוד הגן in vivo בשלבים מאוחרים יותר. עוברים מתוך E4 לפחות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם קרן המחקר הגרמנית (DFG, LU1455/1-1).
Luo, J., Yan, X., Lin, J., Rolfs, A. Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4078, doi:10.3791/4078 (2012).