Summary

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי<em> לג'ימי לשעבר</em> Electroporation

Published: July 27, 2012
doi:

Summary

השיטה של ​​העברת גנים לעוברי עוף בשלבי דגירה מאוחר יותר (מעל גיל המבורגר המילטון הבמה (ה"ה) 22) מתואר. שיטה זו מתגברת על החסרונות של<em> ב לג'ימי</emElectroporation> להחיל על עוברי תרנגולת מבוגרים היא טכניקה יעילה כדי ללמוד לתפקד גנים ורגולציה בשלבים התפתחותיים מבוגרים.

Abstract

העובר עוף מספקת המערכת מודל מצוין לחקר תפקוד גנים ורגולציה במהלך ההתפתחות העוברית. ב electroporation לג'ימי היא שיטה רבת עוצמה יתר מבטאים גנים חיצוניים או למטה, להסדיר גנים אנדוגניים in vivo עוברי עוף 1. מבנים שונים כגון פלסמידים דנ"א גנים קידוד 2-4, קטן מפריע RNA (siRNA) פלסמידים 5, קטן סינתטי RNA oligos 6, morpholino אנטיסנס 7 ניתן transfected בקלות על ידי electroporation לעוברי עוף. עם זאת, היישום של ב electroporation לג'ימי מוגבל עוברים בשלבים מוקדמים דגירה (צעירים יותר בשלב HH20 – פי המבורג המילטון) 8 ויש כמה חסרונות עבור היישום שלה עוברים בשלבים מאוחרים יותר (מעל גיל הבמה HH22 – כ 3.5 ימים של פיתוח). לדוגמה, קרום vitelline בשלבים מאוחרים יותר הוא usuברית דבק הממברנה יקבע ו פתיחת חלון במעטפת גורמת לקרע של כלי הדם, והתוצאה היא מוות של העוברים, עוברים הבוגרים מכוסים על ידי כלי vitelline ו allantoic, שם קשה לגשת ולטפל בעוברים, עוברים הבוגרים לעבור במרץ קשה לשלוט בכיוון דרך חלון קטן יחסית הקליפה.

בפרוטוקול זה אנחנו מדגימים את השיטה לשעבר electroporation לג'ימי להעברת גנים לעוברי עוף בשלבים המאוחרים (מבוגר בשלב HH22). עבור electroporation לג'ימי לשעבר, עוברים מתורבתים בצלחות פטרי 9 ו vitelline וכלי allantoic מופצים באופן נרחב. בתנאים אלה, העוברים את העוף מבוגרים ניתן לגשת בקלות מניפולציה. לכן, שיטה זו מתגברת על החסרונות של ב electroporation לג'ימי להחיל את עוברי עופות גדולים יותר. באמצעות שיטה זו, פלסמידים ניתן transfected בקלות לחלקים שוניםשל עוברי תרנגולת מבוגרים 10-12.

Protocol

1. אקס לג'ימי תרבות ביציות מופרות טריות מוטלות על הצד הארוך שלהם כפייה טיוטת חממה (BSS160, Ehret, גרמניה) ב 37.5 מעלות צלזיוס עם לחות 60% עבור הדגירה. ביצים המאוחסנים על 12 מעלות צלזיוס במשך שבוע יותר מ 1 אין להשתמש. <li style=";…

Discussion

פרוטוקול זה מספק הוראות להעברת גנים לעוברי עוף מבוגרים (למשל, אל tectum אופטיים ב E6) על ידי electroporation לג'ימי לשעבר. שיטה זו מרחיבה את השימוש electroporation כדי עוברי עוף מבוגרים ניתן ליישם בקלות במעבדות רבות לחקר תפקוד הגן in vivo בשלבים מאוחרים יותר. עוברים מתוך E4 לפחות …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם קרן המחקר הגרמנית (DFG, LU1455/1-1).

Materials

Name Company Catalog Number
Electroporator Nepa Gene, Japan CUY21-Edit
Electrodes Nepa Gene, Japan CUY661-3×7
Egg incubator Ehret, Germany BSS160
Embryo incubator BINDER GmbH, Germany  
Fluorescent microscope Keyence, Deutschland GmbH BZ-8000
Petri dish Greiner Bio-One GmbH, Germany  
Microelectrode puller World Precision Instruments, Germany PUL-100

References

  1. Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  2. Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
  3. Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
  4. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
  5. Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
  6. Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
  7. Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  9. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
  10. Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
  11. Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
  12. Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).

Play Video

Cite This Article
Luo, J., Yan, X., Lin, J., Rolfs, A. Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4078, doi:10.3791/4078 (2012).

View Video