Summary
Un metodo di trasferimento genico in embrioni di pollo in fasi successive di incubazione (più di Hamburger e Hamilton stadio (HH) 22) è descritto. Questo metodo supera inconvenienti
Abstract
L'embrione di pollo fornisce un ottimo sistema modello per studiare la funzione del gene e la regolazione durante lo sviluppo embrionale. In elettroporazione ovo è un metodo efficace per geni esogeni over-espressa o down-regolare i geni endogeni in vivo in embrioni di pollo 1. Di strutture diverse come i geni codificanti del DNA plasmidi 2-4, piccoli RNA interferenti (siRNA) 5 plasmidi, piccoli RNA sintetico oligos 6 e 7 morpholino oligonucleotidi antisenso può essere facilmente trasfettati in embrioni di pollo mediante elettroporazione. Tuttavia, l'applicazione di elettroporazione in ovo è limitata a embrioni nelle fasi iniziali di incubazione (meno di stage HH20 - in base ad Amburgo e Hamilton) 8 e ci sono alcuni svantaggi per la sua applicazione in embrioni in fasi successive (più vecchio di stage HH22 - circa 3,5 giorni di sviluppo). Ad esempio, la membrana vitellina in fasi successive è solitamentealleato attaccato alla membrana deve e aprendo una finestra nel guscio provoca la rottura dei vasi, con conseguente morte degli embrioni; vecchi embrioni sono coperti da navi vitellina e allantoico, dove è difficile accedere e manipolare gli embrioni; vecchi embrioni spostare vigorosamente ed è difficile controllare l'orientamento attraverso una finestra relativamente piccola nel guscio.
In questo protocollo si dimostra un metodo di elettroporazione ex ovo per il trasferimento del gene in embrioni di pollo nelle fasi tardive (di età superiore a stage HH22). Per elettroporazione ex ovo, gli embrioni vengono coltivati in piastre di Petri 9 e il vitellino e vasi allantoide sono ampiamente diffuse. In queste condizioni, gli embrioni di pollo anziani sono facilmente accessibili e manipolati. Pertanto, questo metodo supera gli svantaggi della elettroporazione in ovo applicata ai vecchi embrioni di pollo. Utilizzando questo metodo, plasmidi possono essere facilmente trasfettato in parti differentidegli embrioni di pollo anziani 10-12.
Protocol
1. Cultura Ex ovo
- Freschi uova fecondate sono stabiliti sul loro lato lungo in un forzata progetto incubatore (BSS160, Ehret, Germania) a 37,5 ° C con 60% di umidità per l'incubazione. Uova conservati a 12 ° C per più di una settimana non dovrebbe essere usato.
- Dopo incubazione per 2,5 giorni (circa fase HH17), estrarre le uova ed etichettare la parte superiore con una matita per indicare la direzione per il cracking.
- Prima di cracking, versare circa 20 ml di acqua distillata sterile in un grande piatto pulito Petri (diametro di 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Germania).
- Posizionare un altro piccolo piastra di Petri sterile (diametro di 94 mm; Greiner Bio-One GmbH) nel grande piatto Petri.
- Rompere le uova sul fondo contro un bordo di metallo affilato, aprire con cautela le uova e trasferire l'intero contenuto di ciascun uovo nella piccola scatola di Petri.
- Coprire il piatto grande Petri con un coperchio e metterlo in un altro incubatore (Binder GmbH, Tuttlinge, Germania)per la cultura ulteriormente a 37,5 ° C con circa il 60% di umidità. Dopo incubazione per il numero desiderato di giorni, gli embrioni possono essere utilizzati per elettroporazione.
2. Preparazione per l'ex ovo Elettroporazione
- Pull in vetro capillari con un estrattore microelettrodo (PUL-100 Micropipetta Puller, strumenti di precisione del Mondo, Berlino, Germania) utilizzando tubi di vetro di 1,0 mm di diametro (TW100F-4; Strumenti di precisione del Mondo) e rompere la punta dei capillari di vetro in un apposito diametro.
- Impostare i parametri appropriati (ad esempio, tensioni diverse per i diversi tessuti e dimensioni di embrioni) per l'elettroporazione e collegare gli elettrodi a un elettroporatore (CUY21-Edit, Nepa Gene, Chiba, Giappone) in base ai tessuti bersaglio e le dimensioni di embrioni.
- Preparare una soluzione plasmide contenente plasmidi a vettore pCAGGS codificano un gene bersaglio, ad es cadherin7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 con una concentrazione di 2,0 pg / pl) e un gene marcatore,ad esempio, proteina verde fluorescente (GFP; pCAGGS-GFP con una concentrazione di 0,25 mg / pl). Poi aggiungere verde veloce con una concentrazione finale di 0,1% (Sigma) per marcare la soluzione plasmide con il colore verde.
- Caricare il capillare di vetro con la soluzione plasmide usando una pipetta a bocca.
3. Il trasferimento genico in Tectum pollo ottica da ex ovo Elettroporazione
- Dopo coltura ex ovo, ad esempio, di giorno incubazione (E) 6, gli embrioni di pollo sono utilizzati per esempio elettroporazione ovo.
- Attenzione allo strappo le membrane amnios vitellina e il tetto ottico con una pinza sottili e aggiungere 3 gocce di soluzione sterile con sodio cloruro 0,9% sulla superficie del Tectum.
- Iniettare la soluzione plasmide nella cavità del tectum dal capillare di vetro usando la pipetta bocca.
- Posizionare gli elettrodi con un catodo ago di tungsteno e un anodo di piastra rettangolo (Cuy 661-3x7, Nepa Gene) accanto al Tectum eapplicare immediatamente impulsi elettrici (sei impulsi, 25 V, 60 ms lunghezza di impulso, a intervalli di 100 ms in ogni caso) prodotte dalla elettroporatore al Tectum.
- Coprire il piatto Petri grande con il coperchio e restituirla nell'incubatore. Dopo incubazione per giorno appropriate (ad esempio, 2 o 3 giorni dopo l'elettroporazione), il tectum sono raccolti e fissati per immunocolorazione (figura 1) e il rilevamento biologico.
4. Risultati rappresentativi
Sovraespressione successo delle proteine esogene di Cad7 e GFP da ex elettroporazione ovo è illustrato nella figura 1 come esempio. Quando Cad7 insieme plasmide con GFP plasmide è stato elettroporata in tectum a E6, due o tre giorni dopo l'elettroporazione gli embrioni sono stati raccolti e fissati. Al E8, la proteina GFP è fortemente espresso nel tetto in intere immagini montaggio (Figura 1A-C). Inoltre, nelle sezioni del tectum a E9,Proteina GFP (verde in figura 1D) e Cad7 proteina (rosso in Figura 1E) sono coespressa (giallo in figura 1F), suggerendo che ex elettroporazione ovo è un metodo efficace per il trasferimento genico in gli embrioni di pollo anziani in vivo.
Figura 1. Quando il plasmidi codifica GFP e Cad7 sono cotransfected nel tectum pollo a E6, due o tre giorni dopo l'elettroporazione ex ovo, proteina GFP (verde) è fortemente espresso come mostrato in immagini wholemount (AC) a E8. Nelle sezioni del tectum a E9, proteina GFP (green in D) e Cad7 proteine (rosso in E) sono coespressi (giallo in F). BF, immagine campo chiaro. Scale bar: 200 micron in A per AC; 100 micron di D per DF.
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Discussion
Questo protocollo fornisce una guida per il trasferimento del gene in embrioni di pollo grandi (ad esempio, nel tetto ottico a E6) di elettroporazione ex ovo. Questo metodo estende l'utilizzo di elettroporazione di embrioni di pollo anziani e può essere facilmente applicato a molti laboratori per lo studio della funzione genica in vivo in fasi successive. Gli embrioni da E4 ad almeno E7 può essere successo elettroporate con questo metodo e gli embrioni possono essere elettroporate sopravvivenza fino E15 11. Oltre al cervello, questo metodo può essere utilizzato anche per il trasferimento genico nel sistema arto pollo 11.
Particolare attenzione deve essere rivolta alla elettroporazione da ex ovo. Ad esempio, per ottenere un'elevata sopravvivenza degli embrioni di coltura ex ovo, uova utilizzate devono essere fresco e conservate meno di una settimana a 12 ° C; i piatti Petri piccole deve essere sterile e uovo crepe eseguita a circa E2.5. Per elettroporazione ex ovo, ladimensioni e la posizione degli elettrodi deve essere correttamente scelti in base alla scena e parte mirata degli embrioni. Quando due plasmidi sono cotransfected, i plasmidi iniettato dovrebbe essere in un appropriato rapporto di concentrazione (ad esempio, 1:8 tra il gene marcatore e il gene GFP mirato) per essere sicuri che le cellule GFP segnati sono quasi coesprimere il gene preso come bersaglio.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione per la ricerca tedesco (DFG, LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
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