Summary
وصفت وهناك طريقة لنقل الجينات إلى أجنة الدجاج في مراحل الحضانة في وقت لاحق (أقدم من هامبورغ وهاملتون مرحلة (سمو) 22). هذا الأسلوب يتغلب على عيوب
Abstract
الجنين الدجاج ويوفر نظام نموذجا ممتازا لدراسة وظيفة الجين والتنظيم أثناء التطور الجنيني. في electroporation OVO هو وسيلة قوية لالافراط في التعبير عن الجينات الخارجية أو أسفل تنظيم الجينات الذاتية في الجسم الحي في أجنة الدجاج 1. ويمكن هياكل مختلفة مثل جينات الحمض النووي الترميز البلازميدات 2-4، صغيرة تدخل الحمض النووي الريبي (سيرنا) البلازميدات 5، صغيرة الاصطناعية RNA oligos 6، و [أليغنوكليوتيد] morpholino العقاقير 7 transfected بسهولة في أجنة الدجاج بواسطة electroporation. ومع ذلك، يقتصر تطبيق في electroporation البيضة إلى الأجنة في مراحل الحضانة في وقت مبكر (الذين تقل أعمارهم عن مرحلة HH20 - وفقا لهامبورغ وهاملتون) 8، وهناك بعض المساوئ لتطبيقه في الأجنة في مراحل لاحقة (أقدم من مرحلة HH22 - ما يقرب من 3.5 أيام التنمية). على سبيل المثال، الغشاء المحي في مراحل لاحقة هو أوسوحليف تمسك الغشاء يجب وفتح نافذة في وعاء يسبب تمزق في الأوعية، مما أدى إلى وفاة الأجنة، وتغطي أقدم الأجنة بواسطة السفن المحي والسقاء، حيث أنه من الصعب الوصول إليها والتلاعب في الأجنة، أقدم أجنة تحرك بقوة ويصعب السيطرة على التوجه من خلال نافذة صغيرة نسبيا في وعاء.
في هذا البروتوكول نظهر سابق الأسلوب electroporation OVO لنقل الجينات في أجنة الدجاج في المراحل المتأخرة (أقدم من مرحلة HH22). لelectroporation OVO السابقين، تستزرع الأجنة في أطباق بتري (9) وتنتشر على نطاق واسع المحي والأوعية السقاء. في ظل هذه الظروف، يتم الوصول إليها بسهولة الأجنة أقدم الدجاج والتلاعب بها. ولذلك، هذا الأسلوب يتغلب على عيوب في electroporation OVO تطبيقها على الأجنة أقدم الدجاج. باستخدام هذه الطريقة، يمكن البلازميدات transfected بسهولة إلى أجزاء مختلفةمن أجنة الدجاج أقدم 10-12.
Protocol
1. سابق الثقافة OVO
- وضعت جديدة البويضات المخصبة على الجانب الطويل في حاضنة القسري مشروع-(BSS160، Ehret، ألمانيا) على 37،5 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ للحضانة. لا ينبغي أن البيض المخزنة في 12 درجة مئوية لمدة أطول من أسبوع واحد يمكن استخدامها.
- بعد حضانة لمدة 2.5 أيام (حوالي مرحلة HH17)، واخراج البيض وتسمية قمة مع قلم رصاص للإشارة إلى الاتجاه للتكسير.
- قبل الانشقاق، صب حوالي 20 مل ماء مقطر معقم في طبق بيتري كبيرة نظيفة (قطره 145 ملم؛ غرينر بيو واحد GmbH، ألمانيا).
- مكان آخر صغير طبق بتري معقمة (قطرها 94 مم؛ غرينر بيو واحد محدودة) في طبق بيتري كبيرة.
- كسر البيض على الجزء السفلي من حافة معدنية حادة، فتح بعناية البيض ونقل المحتوى بالكامل من كل البيض في صحن صغير بيتري.
- تغطية صحن بيتري كبير مع غطاء وضعه في حاضنة أخرى (BINDER محدودة، Tuttlinge، ألمانيا)لمزيد من الثقافة في 37،5 درجة مئوية مع رطوبة حوالي 60٪. بعد مرور فترة الحضانة للعدد المطلوب من أيام، ويمكن استخدام هذه الأجنة لelectroporation.
2. استعدادا لElectroporation OVO السابقين
- سحب الزجاج الشعيرات الدموية مع مجتذب microelectrode (PUL-100 Micropipette بولير، أدوات دقيقة العالمية، برلين، ألمانيا) باستخدام أنابيب زجاجية من 1.0 ملم وقطرها (TW100F-4؛ أدوات دقيقة الدولي)، وكسر غيض من الشعيرات الدموية إلى زجاج مناسبة قطر.
- إعداد المعلمات المناسب (على سبيل المثال، مختلف الجهود لأنسجة متميزة وحجم الأجنة) لelectroporation وتوصيل الأقطاب الكهربائية إلى electroporator (CUY21-تحرير؛ نيبا جين، تشيبا، اليابان) وفقا للالأنسجة المستهدفة وحجم الأجنة.
- يعد حل البلازميد التي تحتوي على البلازميدات في ناقلات pCAGGS ترميز الجين الهدف، على سبيل المثال، cadherin7 (Cad7؛ pCAGGS-Cad7 مع تركيز قدره 2.0 ميكروغرام / ميكرولتر) وجين علامة،على سبيل المثال، أخضر فلوري البروتين (GFP؛ pCAGGS-GFP مع تركيز 0.25 ميكروغرام / ميكرولتر). ثم يضاف الأخضر سريع مع التركيز النهائي لل0.1٪ (سيجما) لتسمية حل البلازميد مع اللون الأخضر.
- تحميل زجاج الشعرية مع الحل البلازميد باستخدام ماصة الفم.
3. نقل الجينات إلى السقف الدجاج البصرية بواسطة Electroporation OVO السابقين
- بعد ثقافة OVO السابقين، على سبيل المثال، بعد يوم حضانة (E) 6، يتم استخدام أجنة الدجاج لelectroporation OVO السابقين.
- تمزق الأغشية بعناية المحي والسلى على السقف البصري مع ملقط غرامة وإضافة 3 قطرات من معقم 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم على السطح من السقف.
- حقن حل البلازميد في تجويف من السقف بواسطة زجاج شعري باستخدام ماصة الفم.
- وضع أقطاب كهربائية مع التنغستن القطب السالب إبرة وأنود لوحة المستطيل (CUY 661-3x7، نيبا جين) بجانب السقف، وتطبق فورا نبضات كهربائية (6 البقول، و 25 V، 60 طول نبض مللي و 100 مللي فترات في كل حالة على حدة) التي تنتجها electroporator إلى السقف.
- تغطية صحن بيتري كبير مع غطاء وإعادته إلى الحاضنة. بعد حضانة لأيام المناسب (على سبيل المثال، 2 أو 3 أيام بعد electroporation)، يتم جمع والسقف المحدد لالمناعية (الشكل 1)، وكشف البيولوجية.
4. ممثل النتائج
ويرد overexpression الناجح للبروتينات خارجية من Cad7 وGFP بواسطة electroporation OVO السابقين في الشكل 1 كمثال على ذلك. عندما electroporated Cad7 معا البلازميد مع GFP البلازميد في السقف في E6، يومين أو ثلاثة أيام بعد electroporation تم جمع الأجنة وثابتة. في E8، يتم التعبير عن هذا البروتين GFP بقوة في السقف في صور جبل كامل (الشكل 1A-C). وعلاوة على ذلك، في أجزاء من السقف في E9،GFP بروتين (الأخضر في الشكل 1D) وCad7 بروتين (الحمراء في الشكل 1E) هي coexpressed (الصفراء في 1F الشكل)، مما يوحي بأن electroporation OVO السابق هو وسيلة ناجحة لنقل الجينات في الأجنة أقدم الدجاج في الجسم الحي.
الشكل 1. عندما يتم cotransfected في البلازميدات GFP الترميز وCad7 في السقف الدجاج في E6، يومين أو ثلاثة أيام بعد electroporation OVO السابقين، وأعرب بقوة بروتين GFP (الأخضر) كما هو مبين في الصور wholemount (AC) في E8. في أجزاء من السقف في E9، GFP البروتين (أخضر في D) وCad7 البروتين (أحمر في E) هي coexpressed (الصفراء في F). BF، مشرق صورة مجال. مقياس شريط: 200 ميكرومتر في ألف لAC؛ 100 ميكرون في التطوير لمدافع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يوفر دليلا لنقل الجينات إلى أجنة أقدم الدجاج (على سبيل المثال، في السقف البصري في E6) بواسطة electroporation OVO السابقين. وتمتد هذه الطريقة على استخدام electroporation إلى أجنة الدجاج وكبار السن ويمكن تطبيقها بسهولة على العديد من المختبرات لدراسة وظيفة الجينات في الجسم الحي في مراحل لاحقة. ويمكن أجنة من E4 إلى ما لا يقل عن E7 electroporated بنجاح من قبل هذه الطريقة والأجنة electroporated يمكن أن يكون البقاء على قيد الحياة حتى E15 11. وبالاضافة الى الدماغ، يمكن أن هذه الطريقة تستخدم أيضا لنقل الجينات إلى الدجاج نظام أطرافهم 11.
وينبغي إيلاء اهتمام خاص من قبل electroporation OVO السابقين. على سبيل المثال، من أجل الحصول على البقاء على قيد الحياة عالية من الأجنة من قبل ثقافة OVO السابقين، وينبغي أن تستخدم البيض تكون طازجة وتخزينها أقل من أسبوع واحد على 12 درجة مئوية، وأطباق بتري الصغيرة يجب أن تكون عقيمة وتكسير البيض التي تجري في جميع أنحاء E2.5. لelectroporation OVO السابقين، ووينبغي أن حجم ووضع أقطاب كهربائية اختيار بشكل صحيح وفقا لمرحلة وجزء المستهدفة من الأجنة. عندما يتم cotransfected البلازميدات اثنين، ويجب أن يكون حقن البلازميدات في نسبة مناسبة من التركيز (على سبيل المثال، بين 1:08 علامة جين GFP والجينات المستهدفة) من أجل التأكد من أن الخلايا GFP ملحوظ وcoexpress تقريبا في الجينات المستهدفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق منحة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG؛ LU1455/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit | |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3x7 | |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 | |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | ||
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | ||
| Micr–lectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
