Gentransfer in Hühnerembryonen durch Ältere<em> Ex ovo</em> Die Elektroporation
Summary
Verfahren zum Gentransfer in Hühnerembryos in späteren Stufen der Inkubation (älter als Hamburger und Hamilton Stufe (HH) 22) beschrieben. Dieses Verfahren überwindet die Nachteile der<em> In-ovo-</em> Elektroporation angewendet, um älteren Hühnerembryonen und ist eine nützliche Technik, um Gen-Funktion und Regulation bei älteren Entwicklungsstadien zu studieren.
Abstract
Der Hühnerembryo bietet ein exzellentes Modellsystem zur Untersuchung von Gen-Funktion und Regulation während der embryonalen Entwicklung. In ovo Elektroporation ist eine leistungsfähige Methode, um Over-Express exogenen Genen oder unten zu regulieren endogene Gene in vivo in Hühnerembryonen 1. Unterschiedliche Strukturen wie DNA-Plasmide kodierenden Gene 2-4, small interfering RNA (siRNA) Plasmide 5, kleine synthetische RNA Oligos 6 und 7 Morpholino Antisense-Oligonukleotide können problemlos in Hühnerembryonen werden durch Elektroporation transfiziert. Allerdings ist die Anwendung der in-ovo-Elektroporation von Embryonen in frühen Stadien Inkubation (jünger als Bühne HH20 – nach Hamburg und Hamilton) beschränkt 8 und gibt es einige Nachteile für die Anwendung in Embryonen in späteren Stadien (älter als Stadium HH22 – rund 3,5 Tag der Entwicklung). Zum Beispiel ist die Vitellin-Membran in einem späteren Stadium USUVerbündete hielt sich an die Membran shall und Öffnen eines Fensters in der Schale verursacht Bruch der Gefäße, was zu dem Tod der Embryonen; älteren Embryonen werden durch Dottergang und Allantois-Gefäße, in denen es schwierig ist, zugreifen und sie manipulieren die Embryonen fallen; älteren Embryonen bewegen kräftig und es ist schwierig, die Orientierung durch eine relativ kleine Fenster in der Schale zu kontrollieren.
In diesem Protokoll zeigen wir eine ex ovo Elektroporation Methode für den Gentransfer in Hühnerembryonen in späten Stadien (älter als Stadium HH22). Für ex ovo Elektroporation werden Embryonen in Petrischalen kultiviert und 9 die Vitellin und Allantois-Gefässe sind weit verbreitet. Unter diesen Bedingungen werden die älteren Hühnerembryonen leicht zugänglich und manipulierbar. Daher überwindet dieses Verfahren die Nachteile der in-ovo-Elektroporation, die auf die älteren Hühnerembryonen. Mit dieser Methode können Plasmide leicht in verschiedenen Teilen transfiziert werdender älteren Hühnerembryonen 12.10.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll stellt einen Leitfaden für den Gentransfer in älteren Hühnerembryonen (z. B. in das Tectum opticum bei E6) von ex ovo Elektroporation. Diese Methode erweitert die Verwendung von Elektroporation, um älteren Hühnerembryonen und kann leicht an vielen Labors zur Untersuchung von Genfunktionen in vivo in späteren Stadien angewendet. Embryonen aus der E4 bis E7 zumindest kann erfolgreich mit dieser Methode elektroporiert werden, und die Embryonen können elektroporierte Überleben sein…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (; LU1455/1-1 DFG) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3×7 |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | |
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | |
| Microelectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
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