पुराने चिकन भ्रूण में जीन द्वारा स्थानांतरण<em> पूर्व ओवो</em> Electroporation
Summary
बाद में ऊष्मायन चरणों (हैम्बर्गर और हैमिल्टन (एच एच) मंच 22 से अधिक उम्र) में चिकन भ्रूण में जीन स्थानांतरण की एक विधि का वर्णन है. इस विधि के नुकसान पर काबू<em> ओवो में</em> Electroporation बड़े चिकन भ्रूण के लिए आवेदन किया है और जीन समारोह और बड़े विकास के चरणों में विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है.
Abstract
चिकन भ्रूण भ्रूण विकास के दौरान जीन समारोह और विनियमन के अध्ययन के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली प्रदान करता है ओवो electroporation से अधिक व्यक्त बहिर्जात जीनों के लिए एक शक्तिशाली विधि या चिकन एक भ्रूण में vivo में अंतर्जात जीन नीचे विनियमित है. डीएनए plasmids एन्कोडिंग 2-4 जीन, छोटे दखल शाही सेना (siRNA) 5 प्लास्मिड, छोटे कृत्रिम आरएनए 6 oligos, और morpholino antisense oligonucleotides 7 के रूप में विभिन्न संरचनाओं electroporation द्वारा आसानी से किया जा सकता है चिकन भ्रूण में ट्रांसफ़ेक्ट. हालांकि, की ओवो electroporation में आवेदन जल्दी ऊष्मायन (HH20 चरण की तुलना में छोटी – हैम्बर्ग और हैमिल्टन के अनुसार) चरणों में भ्रूण के लिए सीमित है 8 और इसके बाद के चरणों में भ्रूण में आवेदन के लिए कुछ नुकसान (HH22 मंच से अधिक उम्र के हैं – लगभग 3.5 विकास के दिन). उदाहरण के लिए, बाद के चरणों में पीतक झिल्ली अमूमन हैकरेगा झिल्ली खोल में फँस गया है और एक खिड़की खोलने सहयोगी जहाजों के संबंध विच्छेद का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण की मौत, पुराने भ्रूण पीतक और अपरापोषिक वाहिकाओं, जहां यह मुश्किल है के लिए उपयोग और भ्रूण हेरफेर के द्वारा कवर किया जाता है, पुराने भ्रूण चाल सख्ती और खोल में एक अपेक्षाकृत छोटी सी खिड़की के माध्यम से ओरिएंटेशन को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है.
इस प्रोटोकॉल में हम देर चरणों (HH22 मंच से पुराने) में चिकन भ्रूण में जीन स्थानांतरण के लिए एक पूर्व ओवो electroporation विधि प्रदर्शित करता है. पूर्व ओवो electroporation के लिए, भ्रूण पेट्री 9 व्यंजन में संवर्धित कर रहे हैं और पीतक और अपरापोषिक जहाजों को व्यापक रूप से फैले हुए हैं. इन शर्तों के तहत, पुराने चिकन भ्रूण और आसानी से पहुँचा रहे हैं चालाकी से. इसलिए, इस विधि के नुकसान पर काबू ओवो बड़े चिकन भ्रूण के लिए लागू electroporation में. इस पद्धति का उपयोग करके, प्लास्मिड आसानी से विभिन्न भागों में ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता हैबड़े चिकन 10-12 भ्रूण की.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल बड़े चिकन भ्रूण पूर्व ओवो electroporation द्वारा (जैसे, E6 में पर ऑप्टिक tectum के में) में जीन स्थानांतरण के लिए एक मार्गदर्शन प्रदान करता है. इस विधि electroporation की बड़े चिकन भ्रूण के लिए उपयोग प्रदान करता ह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (; DFG LU1455/1-1) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Electroporator | Nepa Gene, Japan | CUY21-Edit |
| Electrodes | Nepa Gene, Japan | CUY661-3×7 |
| Egg incubator | Ehret, Germany | BSS160 |
| Embryo incubator | BINDER GmbH, Germany | |
| Fluorescent microscope | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 |
| Petri dish | Greiner Bio-One GmbH, Germany | |
| Microelectrode puller | World Precision Instruments, Germany | PUL-100 |
References
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
