Summary

Перенос генов в старых куриных эмбрионов на<em> Бывший ово</em> Электропорация

Published: July 27, 2012
doi:

Summary

Метод переноса генов в куриных эмбрионах на более поздних стадиях инкубации (старше гамбургеров и Гамильтон этапе (HH) 22) описывается. Этот метод позволяет преодолеть недостатки<em> В ово</em> Электропорации применяемых к старым куриных эмбрионов и полезный метод изучения функций генов и регулирования в старших стадиях развития.

Abstract

Куриного эмбриона дает прекрасную модельную систему для изучения функций генов и регулирования в процессе эмбрионального развития. Ово электропорации это мощный метод более-экспресс экзогенных генов или вниз регулировать эндогенных генов в естественных условиях на куриных эмбрионах 1. Различные структуры, такие как ДНК, кодирующих генов плазмид 2-4 малых интерферирующих РНК (миРНК) плазмиды 5 небольших синтетических РНК олигонуклеотидов 6 и морфолино антисмысловых олигонуклеотидов 7 можно легко трансфекции в куриных эмбрионах путем электропорации. Тем не менее, применение в ово электропорации ограничивается эмбрионов на ранних стадиях инкубации (моложе этап HH20 – в соответствии с Гамбургом и Гамильтон) 8 и есть некоторые недостатки в его применении у эмбрионов на поздних стадиях (старше этап HH22 – около 3,5 дня развития). Например, желточной оболочки на более поздних стадиях УрГУсоюзника застряли с мембраной должна и открыть окно в оболочке вызывает разрыв сосудов, что приводит к гибели эмбриона, старший эмбрионов покрыты желточного и аллантоисной суда, где трудно получить доступ и управлять эмбрионов; старше эмбрионов двигаться энергично и трудно контролировать ориентацию через относительно небольшое окно в оболочке.

В этом протоколе мы демонстрируем бывший ово метод электропорации для переноса генов в куриных эмбрионов на поздних стадиях (старше этап HH22). Для бывших ово электропорация, эмбрионы культивировали в чашках Петри, 9 и желточного и аллантоисной судах широко распространены. В этих условиях, чем старше куриных эмбрионов легко доступны и манипулировать. Таким образом, этот метод устраняет недостатки в ово электропорации применяется к старшему куриных эмбрионов. Используя этот метод, плазмиды могут быть легко трансфекции в разных частяхстаршего куриных эмбрионов 10-12.

Protocol

1. Ex ово культуры Свежие оплодотворенные яйца откладываются на их длинной стороне в принудительной проект инкубатора (BSS160, Эрет, Германия) на 37,5 ° С, влажности 60% для инкубации. Яйца хранились при температуре 12 ° С в течение более одной недели, не должны использоваться. Пос…

Discussion

Этот протокол представляет собой руководство для переноса генов в старые куриных эмбрионах (например, в оптических покрышки на E6) экс ово электропорации. Этот метод расширяет возможности использования электропорации пожилых куриных эмбрионов и могут быть легко применены для мно…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом от немецкого исследовательского фонда (DFG, LU1455/1-1).

Materials

Name Company Catalog Number
Electroporator Nepa Gene, Japan CUY21-Edit
Electrodes Nepa Gene, Japan CUY661-3×7
Egg incubator Ehret, Germany BSS160
Embryo incubator BINDER GmbH, Germany  
Fluorescent microscope Keyence, Deutschland GmbH BZ-8000
Petri dish Greiner Bio-One GmbH, Germany  
Microelectrode puller World Precision Instruments, Germany PUL-100

References

  1. Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  2. Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
  3. Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
  4. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
  5. Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
  6. Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
  7. Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  9. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
  10. Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
  11. Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
  12. Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).

Play Video

Cite This Article
Luo, J., Yan, X., Lin, J., Rolfs, A. Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4078, doi:10.3791/4078 (2012).

View Video