Summary
이 프로토콜은 하나가 당뇨병 치료를위한 잠재적인 치료 표적을 찾기 위해 기능성 베타 세포 질량을 조절 요소를 식별할 수 있습니다. 프로토콜은 adenoviruses과 유전자 발현의 조작에 따라 분리된 쥐의 islets에 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 간소화된 방법으로 구성되어 있습니다.
Abstract
포도당 항상성은 주로 각각 췌장 베타와 알파 세포에서 분비 내분비 호르몬의 인슐린과 글루카곤에 의해 제어됩니다. 기능성 베타 세포 질량은 해부학 베타 세포 질량뿐만 아니라 영양 하중에 대응하는 베타 세포의 능력에 의해 결정됩니다. 기능적인 베타 세포 대량의 손실은 당뇨병 1-3의 두 주요 형태의 핵심이다. 제 1 형 당뇨병의 면역 공격의 감소 기능성 베타 세포 질량 결과 반해, 제 2 형 당뇨병에이 감소가 적절하게 인슐린을 분비하는 베타 세포의 무능력과 메커니즘의 간부로부터 베타 세포의 파괴 양쪽에서 개발하고 있습니다. 따라서 기능적인 베타 세포 질량을 복원하기위한 노력은보다 나은 치료 및 당뇨병에 대한 잠재적인 치료에 답해야합니다.
노력은 복제를 자극하고 베타 세포의 기능을 향상시키기 위해 악용될 수있는 분자 경로를 식별하는 진행되고 있습니다.이상적인 치료 목표는 베타 세포의 성장과 기능을 모두 향상시킬 것입니다. 하지만 아마도 더 중요한 베타 세포 성장을 자극 전략은 혼란 베타 세포 기능 (예 : 일부 oncogenes과 등)와 그 반대의 비용으로 오는지를 파악하는 것입니다.
고립된 쥐 islets에서 대상 유전자의 체계적 억제하거나 overexpressing 표현함으로써, 하나는 증가 기능성 베타 세포 대량 4-6에 대한 잠재적인 치료 표적을 식별할 수 있습니다. Adenoviral 벡터는 고립된 쥐 islets 4,7-15의 효율적 overexpress 또는 최저의 단백질로 근무하실 수 있습니다. 여기서는 adenoviral 형질 도입을 이용한 유전자 발현을 조작하고 고립된 쥐 islets (그림 1)의 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 방법을 제시한다. 이 메소드는 베타 세포 복제 또는 기능 5,6,8,9,16,17 보죠 소설 대상을 식별하기 위해 이전에 사용되었습니다.
Protocol
1. 쥐 Islets의 Adenoviral 형질 도입 및 Culturing
- 의 필요한 번호 미디어 2 ML (8 MM 포도당 10 % 태아 소 혈청, 50 단위 / ML 페니실린, 50 μg / ML의 스트렙토 마이신을 포함하는 RPMI 1640 미디어)를 추가하여 6 개 잘 아닌 조직 문화 코팅 플레이트를 준비 웰스. 노 바이러스 제어를위한 한 대씩, 바이러스 컨트롤 (예 : GFP-표현 아데노 바이러스)과 실험 집단 - 예를 들어, 일반적인 실험은 세 우물이 필요할 수 있습니다.
- 적어도 30 분 동안 조직 문화 인큐베이터에 그것을 배치하여 37 ° C로 접시를 따뜻하게.
- 바로 6 - 잘 아닌 조직 문화 코팅 플레이트의 개별 우물에 쥐 섬 절연 18,19, 장소 100-200 islets에 따라. 육십 islets은 인슐린 분비 및 thymidine의 정관 assays가 필요합니다. 남은 islets는 유전자 발현 연구 또는 immunoblotting을위한 단백질 분리를위한 RNA 분리에 사용할 수 있습니다.
[참고 :이 시점부터, biohazardous 재료의 취급, 사용 및 처분을위한 제도적 절차를 따르시기 바랍니다.]
- 부드럽게 소용돌이도의 중심에 islets를 가져올 수있는 판.
- 직접 접시의 중앙에 islets에 아데노 바이러스를 피펫. 감염 100-500 multiplicities을 (입니다만, 바이러스성 상패 - 성형 단위로 목표 세포의 비율)를 사용합니다.
- 5 분 동안 islets을 방치 했죠.
- 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2)의 접시를 놓습니다.
- 24 H 후, 부드럽게 소용돌이 우물의 센터로 islets 가지고 잘 신선한 매체를 포함하는 새에 P200 micropipette를 사용 islets를 전송하는 판. islets가 접시에 첨부되어있다면, 그들은 부드럽게 피펫 팁과 dislodged 수 있습니다.
[주 : 적절한 형질 도입의 efficien을 확인하려면islets 그때 섬 핵심으로 아데노 바이러스의 침투를 확인하기 위해 공촛점 현미경을 통해 몇 군데 할 수있는 싸이, 제어 바이러스 표현 GFP의 사용이 유용합니다.]
- 최적화 파일럿 연구에서 실험 원하는 타이밍에 따라 추가로 24-72 H에 대한 문화 islets. 예를 들어, proliferative 반응의 유도는 24-72에서 H 또는 관심있는 유전자의 최저 48 또는 72 시간 요구할 수 이르기까지 시간이 필요할 수 있습니다. 새로운 미디어에 매일에 islets를 전송합니다.
- 실험 1을 포함하는 미디어 문화 islets을의 마지막 24 H 들어 μCi [메틸-3 H] -thymidine/ml 매체 (일반적으로 1 μl thymidine / ML 미디어).
[참고 :이 시점부터, 방사성 물질의 취급, 사용 및 처분을위한 제도적 절차를 따르시기 바랍니다.]
2. 인슐린 분비 분석
- 준비분비 분석 완충액 (SAB) 10X 주식 용액 (1.14 M NaCl, 47 MM KCl, 12 MM KH 2 PO 4, 11.6 MM MgSO 4)와 CaCl 2 100X 주식 용액 (0.25 M CaCl 2). 이러한 주식 솔루션은 미리 준비하고 상온에서 저장할 수 있습니다.
- 갓에서 작동 SAB (10X SAB, 1 M의 HEPES, 100X CaCl 2 0.5 ML 35 % BSA, 0.11 g NaHCO 3의 0.28 ML 1 ML 및 멸균 물 50 ML의 5 ML)의 50 ML 준비 50-ML 튜브 원뿔 따뜻한 37에 ° C ~ 37 ° C waterbath에 배치하여.
- 피펫 10 15 ML 원뿔 튜브로 작업 SAB의 ML하고 높은 포도당 (16.7 ㎜) SAB를 준비하기 위해 2.5 M D-글루코오스의 66.8 μl를 추가합니다.
- 낮은 포도당 (2.8 ㎜) SAB를 준비하는 작업 SAB의 나머지 40 ML에 2.5 M D-글루코오스의 44.8 μl를 추가합니다.
- 라벨 세 1.7-ML microcentrifuge의 6 잘 플레이트의 각 잘위한 튜브하고 인산 버퍼 식염수 (PBS) 1 ML을 추가합니다. [주 : islets는 방사성들에 따라, 방사성 물질의 취급, 사용 및 처분을위한 제도적 절차를 따르시기 바랍니다.]
- 각 microcentrifuge 튜브로 20 islets를 놓습니다. 각 microcentrifuge 튜브에 comparably 크기의 islets을 추가하는 모든 시도를 확인하십시오. 예를 들어, 각각의 튜브는 5 소형, 10 중간, 5 대형 islets합니다 (그림 1 참조)가 포함될 수 있습니다.
- islets 중력 (~ 2 분)에 의해 튜브의 바닥에 정착 후 micropipette으로 PBS를 대기음 및 폐기.
- 사전 배양은 낮은 GLU 400 μl를 추가할편안히 앉다 SAB는 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2), 60 분 미리 품어으로 튜브를 (그들의 뚜껑 열린 포함) 넣습니다. 사전 인큐베이션 낮은 포도당 SAB 및 폐기를 기음.
- 기저 인슐린 분비의 경우 낮은 포도당 SAB 400 μl를 추가, 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2)로 튜브를 (그들의 뚜껑 열고 사용) 배치하고, 60 분 동안 품어. 낮은 포도당 SAB를 수집하고 인슐린 radioimmunoassay 저장.
- 자극 인슐린 분비의 경우 높은 포도당 SAB 400 μl를 추가, 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C에서 5 % CO 2)로 튜브를 (그들의 뚜껑 열고 사용) 배치하고, 60 분 동안 품어. 높은 포도당 SAB를 수집하고 인슐린 radioimmunoassay 저장.
- 한 ML PBS를 추가, islets 중력에 의한 튜브의 바닥에 정착 후, micropipette으로 PBS를 대기음 폐기하고, 이것을 반복한 단계.
- 500 μl 얼음 추위 trichloroacetic 산 (TCA 10 % W / V)를 추가하고 30 분 동안 얼음에 품어.
- 4에 3 분 ° C. 16 000 XG에 튜브를 원심 분리기
- TCA를 대기음, 0.3 N NaOH 80 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. 이 기간 동안 5-10 s에 대한 노골적인 와동 샘플을 매 10 분.
- 7 ML 액체 섬광 계수 튜브로 이코노 안전 계수 칵테일 4 ML을 추가합니다.
- 섬광 계수 튜브에 시료 50 μl를 추가, 튜브를 쏠 잠깐 흔들 및 액체 신틸레이션 계수기로 계산됩니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 bicinchoninic 산성 (BCA) 분석 및 시료 10 μl를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 인슐린 radioimmunoassay를 수행합니다.
- 단백질 conc로 인슐린 분비 및 thymidine의 설립 데이터를 정규화entration.
[주 : Islets는 해부 입체경 또는 표준 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다.]
[주 : 중력에 의해 침강에 대한 대안으로 튜브는 1 분 300 XG에 centrifuged 수 있습니다.]
3. Thymidine의 설립 분석
4. 데이터 분석
5. 대표 결과
쥐 islets의 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 실험의 예는 그림 2에 표시됩니다. 이 예제는 robustly 베타 세포 기능을 변경하지 않고도 섬 복제를 자극 가상 "# 6 진"의 adenoviral overexpression를 보여줍니다. 상단 패널에서 thymidine 결합 분석의 결과는 '진 # 6 "의 표현을 증가하는 등 thymidine의 결합에 의해 측정의 DNA 합성을 증가 것을 보여줍니다. 쥐 섬에있는 세포의 대부분은 베타 세포이기 때문에, 그것은 thymidine의 설립이 증가 베타 세포 복제의 증가를 나타내는 가능성이 높습니다. 그러나 확실한 실험은 단단히 이것을 수립 실시되어야합니다. 하단 패널에서 인슐린 분비 분석의 결과는 '진 # 6 "나, 즉, 기본 베타 세포 기능 중 하나를 변경하지 않은의 overexpression을 보여주낮은 높은 포도당에서 nsulin 분비. adenoviruses과 치료에 따라 islets의 섬 격리와 건강의 품질이 낮은 높은 포도당 농도의 인슐린 분비의 배 증가로 표시됩니다. '진 # 6 "장애인 베타 세포 기능의 표현을 증가하는 경우, 이것은 가능성이 높은 stimulatory 포도당 농도 (16.7 ㎜)에서 분비 인슐린의 감소로 반영됩니다. 포도당 농도를 변화를위한 선량 - 반응 곡선도 수행할 수 있습니다.
그림 1. 유전자 발현의 adenoviral-매개 변경에 따라 분리된 쥐의 islets에 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 프로토콜의 개요. 갓 고립된 쥐 islets 24 H 위해 adenoviruses에 노출된 후 96 H까지 배양해 있습니다. Thymidine의 설립이에서 인슐린 분비의 측정 다음, 마지막 24 H로 평가된다낮은 높은 포도당.
그림 2. 제어 아데노 바이러스와 아데노 바이러스 overexpressing '진 # 6 "으로 표시된 가상의 유전자를 사용하여 실험의 결과. 상단 패널 thymidine의 설립과 하단 패널 인슐린 분비를 보여줍니다.
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Discussion
복제를 자극하고 베타 세포의 기능을 향상시키기 위해 변조된 수 수립 경로는 당뇨병의 두 주요 형태와 관련이 있습니다. 기능적인 베타 세포 질량이 determinants을 평가, 인슐린 - secreting 세포의 존재와 기능에 종속되어 있기 때문에 동시에 그것의 장점이 있습니다. 이 프로토콜은 단백질의 overexpression 또는 억제 그러면 생체내에 효능에 대해 테스트할 수 체외에서 기능적인 베타 세포 질량의 변화로 연결 여부 확인을위한 간소화된 프로토콜을 설명합니다.
이 프로토콜 중 하나는 제한이 섬을 포함하여 여러 세포 유형으로 구성된 마이크로 기관이지만, 알파, 베타, 델타, 엡실론, 그리고 PP 세포에 국한되지한다는 것입니다. 쥐 섬에있는 세포의 80-90%은 베타 세포이기 때문에 섬 복제의 변경 내용이 완전히 베타 세포 복제의 변화로 번역되지 않을 수 있습니다. 가능성을 그 섬에서 관찰된 변화복제가 아닌 베타 세포 복제 존재 때문입니다. 따라서이 프로토콜에 대한 논리적이고 확실한 다음 단계는 immunofluorescence이나 FACS 분석을 5,6에 결합하여 thymidine의 analogs를 이용하여 베타 세포 복제를 검사 수도 있습니다. 이것은 확실한 분석은 또한 확산의 독립 islets로 불특정 thymidine의 설립의 가능성 우려를 완화하실 수 있습니다.
또 다른 잠재적인 단점은 adenoviruses의 형질 도입 효율에있다. 60~70%의 형질 도입 효율을 달성하기 위하여 합리적이지만, 효율성의 핵심 결정자들이 adenoviral 형질 도입의 타이밍이다. 그것은 문화를 빠른 시일 내에 형질 도입 효율을 극대화 adenoviruses의 절연 islets를 필수적입니다. 섬 격리 후 몇 시간 안에 섬이되므로 섬의 핵심 깊숙히 침투하는 아데노 바이러스의 능력을 제한, 계약을 시작한다. 같은 기자 구문의 사용,공촛점 현미경 결합 아데노 표현 GFP는 형질 도입 효율을 평가하기위한 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 다음과 같습니다 1) islets의 동일한 수영장에서 기능적인 베타 세포 대량의 여러 determinants을 테스트의 효율성과 2) 프로토콜 (일반 쥐 섬 절연 400 islets를 얻을)를 수행하는 데 필요한 islets의 작은 숫자 . 이러한 장점이 프로토콜은 적당한 속도로 여러 개의 유전자에 대한 선별 도구로 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (PTF까지)에서 부여 DK078732에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
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