Detta protokoll gör att man kan identifiera faktorer som modulerar funktionella betacellernas massa för att hitta potentiella terapeutiska mål för behandling av diabetes. Protokollet består av en strömlinjeformad metod för att bedöma holmen replikering och betacellsfunktionen i isolerade råttöar efter manipulation av genuttryck med adenovirus.
Glukoshomeostas styrs främst av det endokrina hormoner insulin och glukagon, utsöndras från bukspottkörteln och celler alfa, respektive. Funktionell beta cellmassan bestäms genom den anatomiska beta cellmassan liksom förmågan hos beta-celler att svara på en näringsämnen. En förlust av funktionell beta-cell-massa är central för båda av de större formerna av diabetes 1-3. De sjunkande funktionella massa beta cell resultat från en autoimmun attack i typ 1-diabetes, typ 2-diabetes, utvecklar detta dekrement både en oförmåga betaceller att utsöndra insulin på lämpligt sätt och förstörelsen av beta celler från en kader av mekanismer. Således ansträngningar för att återupprätta fungerande beta-cellmassan är av största vikt för bättre behandling av och potentiella botemedel för diabetes.
Ansträngningar görs för att identifiera molekylära vägar som kan utnyttjas för att stimulera replikering och förbättra funktionen av beta-celler.Idealt skulle terapeutiska mål att förbättra både beta-cell tillväxt och funktion. Kanske viktigare är dock att identifiera om en strategi som stimulerar beta celltillväxt sker på bekostnad försämrad betacellsfunktionen (såsom med vissa onkogener) och vice versa.
Genom att systematiskt undertrycka eller överuttryckande uttrycket av målgener i isolerade råttöar, kan man identifiera potentiella terapeutiska mål för att öka funktionell beta cellmassa 4-6. Adenovirala vektorer kan användas för att effektivt överuttrycker eller knockdown proteiner i isolerade råttöar 4,7-15. Här presenterar vi en metod att manipulera genuttryck använda adenovirala transduktion och bedöma holme replikering och betacellsfunktionen i isolerade råttöar (figur 1). Denna metod har tidigare använts för att identifiera nya mål som modulerar beta cellreplikation eller funktion 5,6,8,9,16,17.
Upprättande vägar som kan moduleras för att stimulera replikation och förbättra funktionen av beta-celler är relevant för båda huvudformer av diabetes. Eftersom funktionell beta-cell massan är beroende av förekomsten och funktionen av insulin-utsöndrande celler, bedöma dessa faktorer samtidigt har sina fördelar. Detta protokoll beskriver en strömlinjeformad protokoll för att identifiera huruvida överuttryck eller undertryckande av ett protein leder till förändringar i funktionell beta-cell-massa in…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag DK078732 från NIH (till PTF).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
[methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
NaCl | Sigma | 59888 | |
KCl | Acros | 42409 | |
KH2PO4 | Acros | 20592 | |
MgSO4 | Acros | 41348 | |
CaCl2 | Acros | 34961 | |
HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
35% BSA | Sigma | A7979 | |
NaHCO3 | Acros | 42427 | |
d-glucose | Sigma | G8769 | |
TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
NaOH | Acros | 12426 | |
Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR |