Summary
Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie is een krachtige techniek voor real-time monitoring van signalering gebeurtenissen in levende cellen met behulp van verschillende biosensoren als verslaggevers. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van in de handel verkrijgbare componenten en hoe deze te gebruiken voor FRET experimenten.
Abstract
Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie blijft winnen toenemende belangstelling als een techniek voor real-time monitoring van biochemische en signalering gebeurtenissen in levende cellen en weefsels. Vergeleken met klassieke biochemische werkwijzen wordt deze nieuwe technologie gekenmerkt door een hoge temporele en ruimtelijke resolutie. FRET proeven met verschillende genetisch gecodeerde biosensoren die kan worden uitgedrukt en de tijd afgebeeld in situ of in vivo 1-2. Typische biosensoren kan melden eiwit-eiwit interacties door het meten FRET tussen een fluorofoor-gemerkte paar eiwitten of conformationele veranderingen in een eiwit dat donor en acceptor fluoroforen verbonden met een bindingsdeel voor een molecuul van belang herbergt 3-4. Bimoleculaire biosensoren voor eiwit-eiwit interacties omvatten bijvoorbeeld constructen ontworpen om G-eiwit activatie in cellen 5 volgen, terwijl de sensors unimoleculaire meaSuring conformationele veranderingen worden op grote schaal gebruikt om beeld second messengers zoals calcium 6, cAMP 7-8, inositol fosfaten 9 en cGMP 10-11. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van enkele commercieel verkrijgbare componenten en hoe je de hele set-up met behulp van de Micro-Manager freeware te controleren. Deze eenvoudige maar krachtige instrument is ontworpen voor routine of meer geavanceerde FRET metingen in levende cellen. Verkregen beelden worden verwerkt met behulp van zelfgeschreven plug-ins voor veranderingen in FRET ratio in real-time visualiseren tijdens een experiment alvorens te worden opgeslagen in een grafische indeling die compatibel is met de ingebouwde ImageJ freeware gebruikt voor de volgende data-analyse. Deze goedkope wordt gekenmerkt door hoge flexibiliteit en met succes kan worden gebruikt om verschillende biochemische gebeurtenissen en signaalmoleculen controleren door een overvloed van beschikbare biosensoren FRET in levende cellen en weefsels. Als voorbeeld tonen we how deze imaging systeem om real-time monitoring van cAMP voeren in levende 293A cellen na stimulatie met een β-adrenerge receptor agonist en blocker.
Protocol
1. Het opzetten van een FRET Imaging Microscoop
In principe kan elk omgekeerde fluorescentiemicroscoop die beschikbaar in het laboratorium en een camera poort worden aangepast voor FRET imaging. De laatste setup moet de volgende cruciale onderdelen: een microscoop, een lichtbron met of zonder extra sluiter, een bundel-splitter voor emissie licht en een CCD-camera (zie figuur 1). De hardware, vooral de lichtbron, de sluiter en de camera zijn geïntegreerd in en gecontroleerd door de beeldvormende software die beeldacquisitie en analyse maakt. Hieronder beschrijven een werkwijze om een eenvoudige montage FRET-systeem commercieel beschikbaar zijn.
- Sluit uw lichtbron aan de microscoop. Gebruik bijvoorbeeld een golflengte licht emitterende diode (CoolLED p E-100, 440 nm) die selectief exciteert verbeterde cyaan fluorescent eiwit (CFP) gebruikt als donor in de meeste FRET biosensoren. Het kan directly en gemakkelijk aan te sluiten op de epifluorescentie verlichting poort van de microscoop. Er zijn ook meerdere golflengten LEDs beschikbaar die kunnen worden aangesloten op een vergelijkbare manier. In plaats van LED, andere standaard lichtbronnen zoals XBO75 xenon arc lamp (vaak gebruikt voor Olympus en Zeiss microscoop) of HBO kwiklamp (doorgaans op Nikon microscoop) worden gebruikt. In het geval van een tl-lamp, moet u ook plaats een sluitertijd tussen de lamp en verlichting poort om software-ondersteunde besturing van de excitatie licht dat op uw steekproef mogelijk te maken. CoolLED vereist geen extra sluiter aangezien direct en uitgeschakeld door de software. Het nadeel van de single-color LED-systemen is een beperkt aantal golflengten, terwijl een fluorescentielamp met verschillende filtersets is een meer flexibele optie, vooral bij het werken met meerdere en bimoleculaire biosensoren. Als alternatief kan monochromator lichtbronnen (bijv. Polychrome V, TILLPhotonics) wordengebruikt, en hebben meestal een geïntegreerde sluiter die kan software-sturing een triggersignaal.
- Plaats een geschikt filter kubus in de microscoop. Voor routine metingen met FRET CFP en verbeterde geel fluorescerend eiwit (YFP) of hun varianten als een paar FRET gebruiken we een eenvoudig filter kubus met een ET436/30M excitatiefilter (die kan worden weggelaten indien LED wordt gebruikt, maar onontbeerlijk bij gebruik van een xenon-of kwiklamp dan LED) en een DCLP455 dichroïsche spiegel. De microscoop moet ook worden uitgerust met een objectief geschikt is voor een goede resolutie fluorescentie microscopie, bijvoorbeeld met een plan-fluor, plan-Neofluar of van plan-apochromat 40x, 60x of 100x olie-immersie objectief.
- Schakel de fluorescerend licht en controleer of de lichtvlek gelijkmatig wordt verdeeld over het gezichtsveld. Indien dit niet het geval is, extra richting van LED lamp of nodig zijn om de optimale verlichting van het monster te bereiken. Dit kan prestatiesmed met behulp van de schroeven die de diode of de lamp in de ruimte te plaatsen.
- Sluit de balk-splitter via een C-mount naar een van de emissie van de microscoop poorten. Gebruik bijvoorbeeld de DV2 DualView (Photometrics), die de emissie licht splitst in twee (donor en acceptor) kanalen die gelijktijdig kunnen worden gecontroleerd op een enkele CCD-camera chip. Ook zijn er andere vergelijkbare producten zoals Optosplit (Cairn Research) of een beam splitter geïntegreerd in de Hamamatsu Orca-D2 dubbele golflengte camera. Voor het CFP / YFP FRET-paar, gebruiken we de 05-EM filterset met de 505dcxr dichroïsche spiegel plus ET480/30M en ET535/40M emissie filters voor CFP en YFP, respectievelijk, die wordt meegeleverd met de DV2. In plaats van een balk-splitter, twee filter blokjes voor de donor (met de ET436/30M excitatiefilter voor GVB, de DCLP455 dichroïsche spiegel en het GVB emissie filter) en acceptor (met het GVB excitatiefilter, DCLP455 en de YFP emissie filter) kanalen worden gebruikt inFRET vele systemen. Als alternatief kan een filter kubus zonder emissiefilter en een automatische emissiefilter wielstand voor de camera geïnstalleerd. In dit geval kan een gemotoriseerde microscoop of het filterwiel afwisselend de twee emissiefilter posities binnen ~ 200-300 msec uitvoeren ratiometrische imaging. Deze kleine vertraging is aanvaardbaar wanneer imaging nogal traag intracellulaire processen, zoals cAMP signalen, waar werkelijk gelijktijdige verwerving van beide kanalen is niet kritisch.
- Sluit de CCD camera (bijvoorbeeld gebruik ORCA-03G of ORCA-R2 van Hamamatsu Photonics) naar de bundeldeler. Gebruik een FireWire-kabel om de camera aan te sluiten op de IEEE1394 computer interface, zoals beschreven in de handleiding die bij de camera. Installeer camera's zonder het inschakelen van de camera.
- Tot slot, om de communicatie tussen de computer en de lichtbron vast te stellen, sluit u de Arduino I / O-kaart (gebruik bijvoorbeeld Arduino Duemilanove of Arduino Uno) om de LED of to de sluiter met een BNC kabel met een normale BNC stekker bevatten de LED zijde en twee afzonderlijke draden aan het andere uiteinde aangesloten op de pennen GND (0) en 8 van het bord zoals in figuur 2. De geassembleerde bord kan rechtstreeks worden aangesloten op een USB-poort van uw computer.
2. Instellen van de Imaging Software
Te controleren en synchroniseren van de lichtbron met vastleggen van het beeld door de camera, moet imaging software worden geïnstalleerd op de computer. Er zijn verschillende commercieel verkrijgbare softwarepakketten waaronder Metafluor (Molecular Devices), Slidebook (Intelligent Imaging Innovations), VisiView (Visitron Systems). Hier laten we zien het gebruik van de open-source Micro-Manager freeware die een hoge mate van flexibiliteit goedkope imaging biedt.
- Download deze software op http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Micro-Manager_Version_Archive. Wij adviseren het installeren van de 1.4.5 versie die gemakkelijk kan worden geconfigureerd in onze handen.
- Sluit de Arduino board op een USB-poort van uw computer. Download de software naar de Arduino bord van controle http://www.arduino.cc/en/Main/software . Volg de instructies op deze website en laat deze software slechts een keer voor het starten van Micro-Manager. Upload een code voor het gebruik van het bord met Micro-Manager software. De code kan worden gedownload op http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
- Schakel de LED en de camera. Start de software en configureer Micro-Manager communicatie met de camera en LED (andere lichtbron en sluitertijd) door Extra> Hardware Configuration Wizard (zie figuur 3). Voeg de vereiste componenten waaronder de camera(Dat wil zeggen Hamamatsu_ DCAM) en Arduino Board (toe te voegen Arduino-Switch, Arduino-Hub en Arduino-Shutter-apparaten). Tijdens de volgende stappen, gebruik dan de standaard instellingen door de wizard. Sla de nieuwe systeemconfiguratie wanneer daarom wordt gevraagd door de wizard.
- Gebruik het hoofdmenu te openen Extra> Apparaatbeheer Property Browser. Scroll naar beneden naar "Arduino Switch Staat" en selecteer "1". Sluit het dialoogvenster. Zorg ervoor dat de "auto-shutter" box is aangevinkt in de belangrijkste software dialoogvenster. Druk op Bestand> Opslaan System State om de software configuratie die altijd moet worden geopend na het starten van de software op te slaan. Dit zorgt voor de communicatie tussen het bestuur en de software die nodig is om beeldacquisitie uit te voeren.
- Druk op de "Live" knop om het signaal van de camera te controleren. Zorg ervoor dat TL-licht gaat elk moment "Live" of "Snap"-functie is geselecteerd. Voor aanvang van de eerste metingen, volgt u de instructies die bij uw bundelsplitser om pervormen de optische uitlijning van beide kanalen.
3. Celkweek en transfecties
- Bereid 6-well platen met geautoclaveerd rond 24 mm glas Dekglaasjes (1 coverslide per putje). Als alternatief kan met glazen bodem cel-cultuur gerechten worden gebruikt.
- Plaat 293A-cellen op de platen of schotels in D-MEM medium (aangevuld met 10% FCS, 1% L-glutamine en 1% penicilline / streptomycine oplossing) zodat de cellen bereikt 50-70% confluentie na een dag.
- 24 uur na het uitplaten transfecteren cellen in een laminaire stroming bank met een FRET sensor plasmide met de calciumfosfaattransfectiemethode (zie 3.5). cAMP biosensor plasmiden kunnen worden verkregen bij onze groep op aanvraag. De lezer wordt ook verwezen naar de uitgebreide recensies 7,8 beschrijven andere beschikbare cAMP biosensoren.
- Voor het transfecteren van cellen voor het eerst bereiden transfectiereagentia. Maken een 2,5 M CaCl2 en 2xBBS oplossingen (de laatste met1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM BES, 280 mM NaCl, op pH 6,95 met NaOH) in gedeïoniseerd water. Steriele filtraat de oplossingen met behulp van een gewone 0,2 um filter.
- Een 6-well plaat of 6 glazen bodem gerechten transfecteren mix 10 ug FRET sensor plasmide werd 50 pi 2,5 M CaCl2-oplossing en steriel water tot 500 pl. Meng goed.
- Voeg 500 pl 2x BBS. Goed mengen en incuberen van het mengsel gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Pipetteer 165 ul van de transfectie mix druppelsgewijs op elk putje of schaal. Roer de plaat en zet het terug in de incubator. Cellen meestal klaar voor FRET metingen 24 uur na transfectie. Zorg ervoor dat cellen niet confluentie bereikt op dit punt, omdat dit de activiteit van verschillende celoppervlaktereceptoren beïnvloeden.
4. FRET Metingen in levende cellen
- Vóór de meting voor het eerst bereiden FRET buffer die 144 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES in gedeïoniseerd water en de pH op 7,3 met NaOH. Verdun de verbindingen te gebruiken in imaging experimenten met de FRET buffer.
- Start de imaging software. Laad eerder gedefinieerde systeemconfiguratie. Selecteer File> Load System State aan een eerder geconfigureerde systeem staat te kiezen.
- Monteer een coverslide met klevende getransfecteerde 293A-cellen in de beeldvorming kamer (bv. Attofluor cel kamer). Ze wast de cellen met FRET-buffer en voeg 400 ul van FRET buffer. Bij gebruik van glazen bodem celcultuur afwas de hechtende cellen en 2 ml van de buffer per schaal. Wij alle metingen bij kamertemperatuur in de FRET buffer bevattende HEPES, zodat geen CO 2 controle nodig is.
- Doe wat immersie olie op het doel en de overdracht van de beeldvorming kamer op de microscoop. Focus op de cellaag met transilluminatie licht.
- Schakel de fluorescerende light door op de "Live" knop, en selecteer een cel voor het experiment. Kies een cel met een optimale sensor uitdrukking, wat betekent dat het moet niet te fel en niet te donker. Na het vinden van een geschikte cel, schakelt u de TL-licht direct om te voorkomen dat fotobleken van de FRET-sensor.
- Pas de belichtingstijd onder "Camera-instellingen" (gewoonlijk 10-50 msec) op een manier die leidt tot een goede signaal-ruisverhouding van het verkregen beeld nadat de "Snap" knop. Te lang excitatie keer zou kunnen leiden tot fotobleken, terwijl te korte tijden resulteren in lage beeldkwaliteit.
- Druk op de "Multi-D Acq." knop en stel het aantal tijdstippen en het tijdsinterval voor beeldacquisitie. Voor onze cAMP-FRET-sensor, verkrijgen we een beeld om de 5 s.
- Start de meting door op de "Acquire" knop.
- Tijdens de meting, kan men gebruik maken van de "FRET online" plug-in (verkrijgbaar in de Online Supplement, alle plug-ins moet copIED in de "plugins" map van uw Micro-Manager-software voordat u het) om toezicht te houden FRET verhouding verandert online. Voer deze plug-in en selecteer een regio van belang in de FRET-verhouding beeld met de "Freehand selecties" tool. Voeg de regio in de ROI manager en druk op de "Get gemiddelde" knop in het "Tijdreeks analyser" venster. De FRET verhouding spoor wordt weergegeven. Om het spoor te werken tijdens de meting, voert u het "FRETratioOnline2" plug-in en druk op de "GetAverage" knop.
- Zodra de FRET verhouding heeft bereikt een stabiele basislijn de gewenste verbinding toepassing nauwkeurig pipetteren deze in de schaal / kamer. Om cellen te behandelen met farmacologische verbindingen kan een perfusiesysteem plaats van eenvoudige pipetteren worden gebruikt in dit stadium.
- Na afloop van de proef, slaat u de time-lapse stapel foto's. Verwijder de meetkamer van de microscoop en reinig het doel via een objectieve weefsel.
- Ga terug naar 4,3 stap om de meting te herhalen met eennieuwe sample.
5. Offline Data Analyse
FRET beeldgegevens kunnen worden geanalyseerd offline op elk moment na het experiment met behulp ImageJ software. Als aanvulling op dit protocol, bieden wij de "FREToffline" plug-in gebruikt in ons laboratorium om de verkregen beelden te splitsen in donor-en acceptor-kanalen en TL-intensiteiten te meten in meerdere regio's van belang. Deze intensiteiten kan verder kopiëren plakken in een Excel-of Origin spreadsheet om de gecorrigeerde FRET te berekenen. Te visualiseren van de FRET veranderingen van unimoleculaire biosensoren, wordt eenvoudig ratiometry vaak gebruikt. In dit geval wordt alleen de donor fluorofoor (CFP) opgewonden en twee beelden genomen CFP en YFP emissiepieken. De berekende YFP / CFP verhouding (soms ook aangeduid als FRET / CFP ratio) geeft de mate van FRET tussen de twee fluoroforen. In unimoleculaire biosensoren, het aantal CFP en YFP-groepen gelijk, zodat het eenvoudig is voldoende ratiometrydoende te vertegenwoordigen de FRET efficiëntie 12.
- Gebruik ImageJ software om het experiment bestand te openen door het selecteren van Plugins> Micro-Manager> Open Micro-Manager Bestand.
- Voer de "FREToffline" plug-in die splitst de time-lapse-stack in individuele CFP en YFP kanalen.
- Indien achtergrondcorrectie wordt gewenst kan worden uitgevoerd met ImageJ software.
- Klik op de YFP stapel foto's en selecteer een of meerdere regio's van belang het gebruik van de "Freehand selecties" tool en voeg ze toe aan de "MultiMeasure" plug-in venster door op de knop 'Toevoegen'.
- Selecteer de regio's van de belangen in de "MultiMeasure" venster en druk op "Multi" naar een tafel te krijgen met een gemiddelde grijswaarden voor elk frame en elke regio. Kopieer de gegevens op het klembord door het selecteren van alle met Ctrl + A en door te drukken op Ctrl + C. Open een Excel of Origin spreadsheet en plak de gegevens door te drukken op Ctrl + V.
De metingen uitgevoerd door het programma kan worden geconfigureerd onder Analyze> Set M easurements waar u kunt de te meten parameters. We meestal alleen selecteren "grijswaarde Mean" in dit dialoogvenster. - Klik op het GVB stapel foto's. Voer dezelfde als beschreven in 5.5. Plak de GVB intensiteit gegevens in dezelfde Excel of Origin spreadsheet.
- Met behulp van Excel of Origin software, berekent de gecorrigeerde FRET verhouding. Als eenvoudige enkele keten unimoleculaire biosensoren worden afgebeeld, corrigeren we alleen voor de bleedthrough van de donor fluorescentie in de acceptor kanaal. In dit geval gecorrigeerde acceptor / donor verhouding:
Ratio = (YFP - B x GVB) / GVB
Wanneer B is de correctiefactor kan worden bepaald door het transfecteren van cellen met plasmide CFP en meten van een percentage van de donor fluorescentie in de YFP kanaal (B = YFP / CFP). Weglaten deze correctie unimoleculaire biosensoren is mogelijk, aangezien dit het algemene amplitude van de respons FRET alleen invloed zonder kwalitatieve effect op de vorm van de curve.
Figuur 1 toont een voorbeeld van een volledig geassembleerd FRET imaging setup bestaande uit een omgekeerde microscoop Nikon, CoolLED, DV2 en DualView Hamamatsu Orca-03G CCD camera. Om de communicatie tussen de hardware componenten en de computer, wordt de I / O Arduino board aangesloten op de computer en de CoolLED zoals weergegeven in figuur 2. Voor het besturen van de lichtbron en vastleggen van het beeld door de camera op een gesynchroniseerde manier, Micro-Manager-software moet worden geïnstalleerd en geconfigureerd (zie figuur 3). Deze freeware kan gemakkelijk worden aangepast aan de individuele behoeften experimentele door toevoeging nodig plug-ins. Figuur 4A toont een representatief ruwe FRET verhouding trace van een meting met cAMP sensor Epac1-kampen 13 uitgedrukt in 293A-cellen om de effecten van β-adrenerge agonist controleren isoproterenol toegepast op tijdstip 150 sec en de & weddena;-blocker propranolol toegevoegd op tijdstip 300 sec (uitgevoerd zoals beschreven in +4,3-+4.10). Deze gegevens kunnen worden geanalyseerd offline en gecorrigeerd voor de bleedthrough van CFP in de YFP kanaal zoals beschreven in 5.1-5.7 het verkrijgen van de gecorrigeerde FRET verhouding trace figuur 4B. Deze representatief experiment toont een langzame daling van de bewaakte FRET verhouding op isoproterenol behandeling die een verhoging van intracellulaire cAMP aangeeft. Propranolol als β-blokker keert de isoproterenol signaal, wat leidt tot een afname van cAMP aan basale niveaus. Deze veranderingen in FRET signaal kan online worden gecontroleerd tijdens een experimenten (zoals beschreven in 4.9). Dergelijke experimenten kunnen worden uitgevoerd met een verscheidenheid van algemeen gebruikte biosensoren ontworpen om verschillende second messengers of biochemische processen.
Figuur 1. Lay-out van de FRET beeldvorming setup bestaat uit een CoolLED, inomgezet Nikon microscoop, DV2 DualView, en ORCA-03G CCD-camera.
Figuur 2. Arduino I / O-kaart en de aansluitingen. Het bestuur is gepositioneerd in een zelf gemonteerde plastic doos. Een standaard BNC-kabel verbindt de LED om de pennen 8 en GND (0) van het bord.
Figuur 3. Screenshots tonen integratie van de onderdelen van het systeem met behulp van Hardware Configuration Wizard. A) Start de Hardware Configuration Wizard. B) de gewenste apparaten toe te voegen, zoals vermeld in 2.3. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Een representatieve experimentele FRETt die cAMP niveaus meet in 293A-cellen getransfecteerd met Epac1-kampen. Eerst werden de cellen gestimuleerd met de β-adrenerge agonist isoproterenol (100 nM op frame 30 of 150 sec) aan cAMP verhogen (waargenomen als een afname in YFP / CFP FRET ratio). Cellen werden vervolgens behandeld met propranolol β-blokker (10 uM, in frame 60 of 300 sec) die leidt tot een toename van FRET verhouding, wat een daling in cAMP. A) Raw online FRET verhouding trace van een gebied van belang overeenkomstige naar een cel gecontroleerd tijdens het experiment. B) gerectificeerd verhouding trace na offline data-analyse uitgevoerd zoals beschreven in 5,1-5,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
in dit protocol, laten we zien hoe je een eenvoudige en goedkope, maar krachtig FRET imaging-systeem voor routinematige toepassingen met een verscheidenheid van beschikbare biosensoren te bouwen. Het systeem hier gepresenteerde is ontworpen voor CFP en YFP, of soortgelijke vormen van fluorescerende eiwitten, omdat de donor-acceptor paar. Ondertussen andere individuele biosensoren beschikbaar die gebruik bijvoorbeeld groen en rood fluorescerende eiwitten 14. De beschreven voor andere kleuren aan, dienen passende lichtbronnen en / of filter sets worden gekozen. Bij LED, een enkele LED lijn, bijvoorbeeld 490 nm te wekken green fluorescent eiwit worden gebruikt. Single golflengte LEDs kan gemakkelijk worden (binnen enkele seconden) gedemonteerde uitgewisseld. Als alternatief zijn er LED arrays beschikbaar die verschillende lijnen bevatten verschillende fluorescerende eiwitten (bijv. pE-2 CoolLED) wekken. Metingen kunnen met alternatieve FRET paren kunnen andere fluorescerende filter blokjes worden geplaatst in de Microsc ope, en uiteindelijk de uitstoot beam-splitter filters moeten worden uitgewisseld. Lichttechniek biedt extra emissie filter schuifregelaars voor DV2 DualView. Aantal recent ontwikkelde toepassingen twee of meer biosensoren gelijktijdig meerdere processen volgen tegelijk, bijvoorbeeld cAMP en cGMP samen in een cel 15. In dit geval wordt een QuadView (Photometrics) met vier emissie kanalen worden gebruikt, de ImageJ plug-in voor beeld splitsen en analyse kan dan worden aangepast voor gebruik met vier kanalen en berekenen twee FRET verhoudingen. ImageJ software is zeer flexibel in termen van beeldanalyse en online weergave van de resultaten. Eenvoudige tekst-editor van plug-ins kan aanpassing van de software-algoritme aan de behoeften van elke individuele imaging-systeem en experiment. Dit is soms zeer behulpzaam en biedt snelle oplossingen voor de technische problemen, die kunnen vereisen lange tijd wanneer ze worden omgezet in commerciële software pakket.
content "> Hierbij FRET proeven, is het belangrijk te voorkomen fotobleken dat verschijnt wanneer de excitatie tijden te lang zijn of wanneer de beelden te vaak genomen. In dit geval kan een foton-geïnduceerde chemische beschadiging of covalente modificaties van fluoroforen optreden en FRET efficiëntie verlagen. fotobleken te vermijden, kan een vermindering van de belichtingstijd en de frequentie van beeldverwerving. Er zijn ook protocollen 12,16 vastgesteld te corrigeren voor dit fenomeen. Tijdens data analyse mogelijk te corrigeren voor de overspraak tussen donor en acceptor kanalen (bleedthrough). Bij gebruik unimoleculaire biosensoren (waarbij donor en acceptor fluoroforen worden altijd uitgedrukt op hetzelfde niveau) voor eenvoudige metingen ratiometrische FRET kan het voldoende zijn om alleen de bleedthrough van de donor naar de acceptor corrigeren kanaal of zelfs helemaal weglaten deze correctie omdat het niet kwalitatief invloed op de vorm van de curve FRET verhouding. Het bleedthrough van ee acceptor in de donor kanaal is meestal te verwaarlozen. Wanneer bimoleculaire biosensoren uit twee verschillende eiwitten worden gebruikt, kunnen deze worden uitgedrukt op verschillende niveaus. In dit geval bleedthrough correctie en een extra correctie voor de directe excitatie door de YFP 440 nm licht is ook raadzaam. Alsjeblieft, raadpleegt u het gepubliceerde protocol 12 waar alle correctie procedures zijn beschreven in meer detail. Extra uitgebreide informatie over de ontwikkeling van biosensoren, microscopie FRET, mogelijke valkuilen van de techniek en over de data-analyse zijn verkrijgbaar in eerder gepubliceerde protocollen 17-18. Kortom, de eenvoudige en krachtige imaging systeem hier beschreven biedt een flexibel platform om verschillende biochemische gebeurtenissen en signaalmoleculen monitoren met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in levende cellen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Anke Rüttgeroth en Karina Zimmermann bedanken voor technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (subsidie NI 1301/1-1 te VON) en de Universiteit van Göttingen Medisch Centrum ("pro Futura" subsidie aan VON).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
